不同载体和农杆菌对苜蓿瞬时表达影响的研究

苜蓿(Medicago sativa)是重要的牧草类植物,为了在苜蓿中有效地实现外源基因的瞬时表达,该研究以绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因,以本氏烟草(Nicotiana benthamiana)作为对比,研究了2种不同的表达载体(非复制型载体和基于菜豆黄矮病毒的复制型载体)、2种不同类型的根癌农杆菌菌株(Agrobacterium tumefa⁃ciens)(LBA4404和EHA105)对苜蓿叶片瞬时表达水平的影响。结果表明,LBA4404与复制型载体的组合(revector/LBA4404)可在苜蓿叶片中有效地实现GFP的瞬时表达。进一步地,研究了re-vector/LBA4404的浓度和侵染后时间对苜蓿叶片瞬时表达的影响。观察显示,随着re-vector/LBA4404菌悬液浓度或侵染后时间的增加,GFP在苜蓿叶片中的瞬时表达水平呈现出先升后降的趋势。菌悬液浓度为1.0(OD600)时,GFP瞬时表达水平最高;侵染后时间为5~7 d时,GFP瞬时表达水平达到峰值。相较于本氏烟草叶片,在苜蓿叶片中实现最高水平的瞬时转化需要更高浓度的农杆菌和更长的侵染后孵育的时间。

农杆菌介导5种中草药叶片瞬时表达的研究

农杆菌介导的瞬时基因表达因其操作简单、可重复性高和实验成本低而成为研究基因功能、生产活性蛋白的有效方法。该研究以非病毒型(载体Ⅰ)和病毒型二元载体(载体Ⅱ)及两种农杆菌(EHA105、LBA4404)为介导,通过叶片渗透法在5种中草药(甘草、黄芩、黄芪、大黄、板蓝根)叶片中进行报告基因GFP的瞬时表达,并对影响表达的因素进行分析,以明确中药材中适宜瞬时表达技术应用的物种材料。结果显示:(1)农杆菌在5种中草药叶片中的瞬时转化效率受到载体、菌株和植物物种类型的影响。(2)在所选的5种中草药植物中,与无转化载体的菌株相比,当农杆菌重悬液OD600为0.8、叶片侵染5~7 d时,含非病毒型二元载体的EHA105菌株在甘草叶片中荧光强度最高,大黄次之;含病毒型二元载体的LBA4404菌株在黄芩叶片中GFP荧光表达量最高;含不同载体的不同菌液侵染的甘草、黄芪叶片仅有注射孔处检测出荧光或几乎无荧光蛋白表达,即未向四周扩散表达;在板蓝根叶片中检测出弱荧光或无荧光强度。研究表明,甘草和黄芩植物叶片可作为农杆菌介导基因瞬时表达的材料。

逆境胁迫对拟南芥细胞质、叶绿体和细胞外ATP水平的影响

利用荧光共振能量转移的ATeam蛋白作为ATP生物传感器,建立检测拟南芥细胞质、叶绿体和细胞外ATP的检测体系,研究植物在不同非生物胁迫(NaCl、 PEG 6000和低温)下细胞质、叶绿体和细胞外ATP水平的变化.结果表明,在较高强度的胁迫(200 mmol/L NaCl、 10%~20%w(PEG6000)和0~4℃)下,细胞质ATP水平下降.在各水平PEG 6000胁迫下,叶绿体中ATP水平保持稳定;10℃低温处理导致叶绿体中ATP水平升高,200 mmol/L NaCl处理导致叶绿体ATP水平下降,其他强度的NaCl以及低温处理未显著改变叶绿体ATP水平.在中等强度的NaCl和PEG 6000胁迫(100 mmol/L NaCl和5%~10%w(PEG 6000))下,细胞外ATP水平升高;4~10℃低温胁迫处理导致细胞外ATP水平下降.

不同磷酸盐供应水平下植物细胞胞内及胞外ATP水平的变化及一氧化氮的调节作用

以BY-2烟草悬浮细胞为实验材料,探究在不同磷酸盐供应水平下细胞内ATP(iATP)、细胞外ATP(eATP)水平的变化以及NO在其中的调节作用.结果表明,随着磷酸盐供应水平的增加,iATP水平呈现上升趋势;伴随着iATP的上升,eATP也呈现相似的变化.与ATP的变化不同,随着磷酸盐供应水平的增加NO水平呈现下降趋势.在正常水平磷酸盐供应下,NO供应剂可增加iATP和eATP水平;NO合成抑制剂降低了iATP和eATP水平.在较低和较高水平的磷酸盐供应下,NO供应剂和合成抑制剂对于iATP和eATP水平的影响呈现与正常水平磷酸盐供应下不同的调节效应,表明磷酸盐供应水平能够影响iATP和eATP的水平;NO对细胞ATP水平具有调节作用,其调节效应与环境磷酸盐供应水平有关.

鄂北地区隧道洞口坡积土边、仰坡变形机制与进洞技术研究

坡积土隧道洞口边、仰坡在开挖后自稳能力差,且受隧道开挖影响,易发生破坏,导致隧道工程无法正常施工,并带来经济损失、危害施工人员安全。本文以香山隧道为工程背景,依据隧址地形地质,建立了隧道洞口边、仰坡的三维仿真模型,结合隧道进洞开挖,分析了洞口边、仰坡的位移和应力变化过程,研究了隧道开挖对边、仰坡的影响,优化了隧道进洞方案。研究结果表明,边、仰坡开挖坡度与原始坡度突变处会产生应力集中并形成贯通的潜在滑移面,隧道开挖对仰坡变形影响较大,坡形坡度对隧道洞口边、仰坡稳定性具有显著影响,放缓坡度和采用分步台阶开挖可有效改善边坡应力应变状态。

栽培方式对苹果贮藏品质的影响

以甘肃省清水县元帅系和静宁县富士系苹果为研究对象,比较覆沙果园果实的贮藏品质指标。结果表明,覆沙果园清水县元帅系苹果单果重增加,总糖、有机酸、Vc含量均上升,而固酸比下降;静宁县富士系苹果可溶性固形物增加,总糖、Vc含量上升,可以较好地保持果实硬度。总体分析,覆沙果园可以提高苹果的贮存性能。

外源ATP对摄磷烟草悬浮细胞生长和活性氧代谢的影响

以BY-2烟草悬浮细胞为实验材料,探究了在缺磷及正常磷供应下外源ATP对烟草悬浮细胞生长和活性氧代谢的影响.结果表明,较之缺磷下生长的细胞,正常磷供应下细胞活力降低,细胞鲜重显著增加,H_(2)O_(2)含量上升而抗氧化酶活性有所下降,其中过氧化物酶(POD)活性的下降最为明显.对缺磷的细胞添加外源ATP使得细胞活性降低,细胞鲜重增加,H_(2)O_(2)含量上升,POD和超氧化物歧化酶(SOD)活性下降,过氧化氢酶(CAT)活性上升.对正常磷供应下的细胞添加外源ATP则导致细胞活性升高,细胞鲜重增加,H_(2)O_(2)含量降低,POD和CAT活性升高,SOD活性下降.上述结果表明,在缺磷及正常磷供应下胞外ATP对细胞的生长和活性氧代谢具有不同的调控作用.

利用荧光共振能量转移检测外源信号分子对拟南芥ATP水平的影响

本研究使用ATP特异性荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)为基础的荧光蛋白传感器(Ateam1.03-nD/nA),分析了4种外源信号分子(细胞外ATP、Ca^(2+)、H_(2)O_(2)和NO)对拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.)幼苗叶绿体和细胞质中ATP水平的影响。结果显示,细胞质ATP水平整体高于叶绿体,在4种不同浓度的信号分子处理下,叶绿体Ateam1.03-nD/nA的FRET比值仅在1.2~1.8波动;细胞质Ateam1.03-nD/nA的FRET比值仅在2.2~3.0之间波动,未产生显著变化。结果表明在以上外源信号分子的作用下,植物细胞质和叶绿体ATP均维持在较为稳定的水平。

细胞外ATP对壳聚糖诱导的叶片活性氧及相关生理反应的影响

以野生型和植物胞外ATP受体缺失突变体(dorn1-3)拟南芥植株为材料,探讨胞外ATP对壳聚糖引起的植株叶片活性氧(ROS)水平、气孔开度以及光系统Ⅱ变化的影响.结果表明,100μg/mL壳聚糖处理下两种类型拟南芥叶片内ROS均显著升高,野生型植株ROS水平升高幅度高于dorn1-3突变型.25~100μg/mL壳聚糖处理会引起野生型拟南芥叶片气孔关闭,且存在浓度梯度效应,但在相应浓度的壳聚糖处理下,不会引起dorn1-3突变型拟南芥叶片中气孔关闭;200μg/mL壳聚糖处理下突变型拟南芥叶片气孔开度降低.与对照组相比,在较低浓度壳聚糖处理下叶片的实际光合效率(Y(Ⅱ))、经过光系统Ⅱ的相对电子传递效率(ETR)和光化学淬灭系数(q P)值都升高,且突变型植株升高的幅度大于野生型;在高浓度壳聚糖处理下,拟南芥叶片Y(Ⅱ)、ETR和q P趋于下降.表明细胞外ATP可能参与调控壳聚糖诱导的ROS、气孔开度以及叶绿素荧光参数的变化.

中国‘苦水’玫瑰杂交育性的初步研究

油用玫瑰主栽品种‘苦水’玫瑰的栽培园区总见千花无果现象,为此,本研究对‘苦水’玫瑰的杂交育性进行了遗传学研究。授粉试验发现,自然授粉和人工辅助授粉时‘苦水’玫瑰自交不结实;异交时‘,苦水’玫瑰作为母本与‘丰花’玫瑰、‘四季’玫瑰、‘艳霞’玫瑰、重瓣黄刺玫之间具有亲和性,而作为父本与杂交母本都无法成功授粉结实。在雄蕊花瓣化、P/O值、花粉异型性和花粉萌发率等生殖特征中发现‘苦水’玫瑰的花粉畸形现象严重,萌发率近似为零。进而,显微观察小孢子母细胞减数分裂各时相发现‘苦水’玫瑰中存在染色体分配行为不协调,胞质分裂不均一,四分体中有三分体等异常现象。由此可见‘苦水’玫瑰的异常减数分裂行为致花粉败育妨碍其做父本时的受精结实,故雄性不育而非蔷薇科常见的自交不亲和性,是‘苦水’玫瑰自交不结实的主要原因,也表明作为母本通过杂交育种方法改良‘苦水’玫瑰的种质是可行的。