整合人mAAT基因转基因山羊的获得

旨在通过动物转基因技术开发奶山羊的乳腺生产治疗人肺纤维性囊肿的新药──人抗 胰蛋白酶因子（人ｍＡＡＴ）。选择繁殖机能优良的奶山羊５６只作为供体，采用ＦＳＨ＋ＬＨ做超 数排卵，获取原核期胚胎，并进行显微注射和鲜胚移植．３月和５月两个月份超排处理后超排 效果明显好于１２月份，分别可获得平均排卵１９．５０、２１．７０和１６．０６枚，受精卵数分别为４．３１、 ６．４８和３．５７枚．显微注射后胚胎移植给供体或自然发情的受体，移植受胎率分别为１８．１８％和 ２５．００％．所生羔羊２９只，对转入外源基因编码区Ｎ－末端和３’调控区部分序列进行ＰＣＲ、 ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测，检出阳性转基因羊羔４只，基因的整合效率为１３．７９％．

利用半定量PCR方法分析中国地方猪种内源病毒序列拷贝数的多态性

研究采用PCR方法检测了我国地方猪种内源病毒的拷贝数 ,希望能够找到拷贝数低或无内源病毒的个体或品种 ,培育一个适用于异种器官移植的品种或品系。共检测了 1 1个品种、2 60个个体 ,贵州猪、五指山猪、巴马猪的内源病毒拷贝数相对较低 ,分别为 34 61± 1 9 0 9、2 9 1 9± 1 3 47和 2 7 1 1± 1 4 46 ,膜蛋白A拷贝数分别为 9 33±6 40、1 0 0 4± 6 51和 1 0 56± 5 39,膜蛋白B拷贝数分别为 2 2 1 7± 9 2 0、2 1 0 0± 1 2 53和 2 1 86± 7 2 0。其他如二花脸猪、梅山猪、沂蒙黑猪、蓝塘猪等基因拷贝数相对较高 ;近交有造成内源病毒基因的拷贝数下降的倾向 ;另外民猪和香猪中分别有一头个体含有内源病毒 2个拷贝、膜蛋白A两个拷贝、膜蛋白B一个拷贝。中国地方猪种中内源病毒的拷贝数间差异较大 ,如进行大规模检测 。

单核细胞的生物学特性及其应用

物种在长期进化过程中已经形成了比较完善的、抵御环境中病原微生物侵袭与感染的免疫系统,并随着物种的进化而进化。具有多能干细胞特性的外周血单核细胞,在非特异性免疫和特异性免疫过程中发挥着非常重要的作用,既能消灭侵入的病原微生物,又能够对病原微生物进行加工处理,将抗原呈递给其他免疫细胞,架起了先天免疫与获得性免疫的桥梁。单核细胞已经在药物靶向传送、消灭肿瘤、疾病监控、细胞治疗、抗病育种、新型疫苗研制、环境检测等领域发挥了重要作用,并获得了良好的实验效果。

孕酮分泌遗传规律的频域分析

选用３～７产成年民母猪２８头，代表９个家系，分别在配种后第６天上午９：００～１１：００间，进行尾部连续采血，间隔１０ｍｉｎ收集血样１次，共采１２点。对外周血中孕酮进行放免测定，并进行傅里叶转换，分辨出幅值。实验中，不同采样点间激素含量变动范围较大，很难得出较为合理的结论。经傅氏转换后，对各频率内幅值进行遗传参数估计：５级谐波为高遗传力（０．９３２），基波、２级、３级谐波为中等遗传力，其他各级谐波为低遗传力。肯定了民猪黄体细胞分泌孕酮能力的特有优势。高遗传力与低遗传力成分的共同存在，说明了孕酮的分泌受着遗传及环境的共同影响。基波、１级及５级谐波与产仔数和产活仔数的相关为负遗传相关，而其他谐波却为正遗传相关，这意味着民猪目前的产仔性能尚未达到最佳状态，还有巨大潜力。各谐波与发情持续期均为负遗传相关，肯定了孕酮对发情症状的抑制作用。但以３级和５级谐波相关强度最大，选择反应最强。由于３级谐波与产仔数及产活仔数为正遗传相关，故应加大对５级谐波的选择强度。民猪血液中孕酮的分泌，在各谐波间尚存在着一定的不平衡，其繁殖潜力有待于进一步挖掘。如采取适当的方法，必然会产生较大的选择反应，进而提高民母猪的繁殖性能。

生殖激素分泌的动态分析

生殖激素分泌的动态分析连正兴盛志廉（东北农业大学动物科学系·哈尔滨·１５００３０）如何提高家畜的繁殖性能，一直是畜牧工作者所面临的大问题。繁殖性状的遗传力较低，单纯从表型进行选择效果不甚理想。内部性状受外界环境因素影响较小，通过对内部性状研究来探讨外...

尾部连续采血法对香猪母猪繁殖性能的影响

本项研究选用畜牧试验站内12头成年、后备香猪母猪各6头,在配种前1～2天及配种后6天的上午9:00～11:00点间,间隔10分钟,进行尾部采血,收集血样12次,观察采血对母猪情期受胎率、仔猪初生重。75天断乳重及产仔数的影响。结果表明:尾部连续采血法对母猪繁殖机能及仔猪发育无不良影响。此法简单,易学,宜于在生产中普遍应用。

犬的发情周期

犬的发情周期连正兴，李武（东北农业大学动物科学系１５００３０）王希平（黑龙江省家畜繁育指导站）随着饲养宠物的兴起，养犬者均希望能得到品质优良、繁殖性能良好的宠物──犬。因此探讨犬的发情机制，以便适时配种，越来越受到养犬者的重视。目前，关于犬的生殖生理...

Ex-FABP作为鸡腹脂性状主要候选基因的研究

细胞外脂肪酸结合蛋白(extracellular fatty acid-binding protein,Ex-FABP)基因是脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding protein,FABP)家族的另一成员,参与鸡的脂肪酸、肌纤维、骨骼等调控过程.利用PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism)和DNA测序的方法,对不同品种的杂交鸡进行了Ex-FABP基因5'调控区部分序列的多态性分析,发现了3个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位点.其中,此片段中的碱基C(-1000)的插入和碱基T→C(-1011)的突变,导致此处比野生型基因少了1个cap,多了1个Nkx-2、1个AhR/Ar和2个CF1等转录因子结合位点的产生.利用SAS软件对Ex-FABP基因5'调控区的SNPs与屠体性状的最小二乘分析,发现基因型BB(突变型)与腹脂重存在极显著相关(P<0.01).研究结果表明,细胞外脂肪酸结合蛋白(Ex-FABP)基因是影响脂肪沉积、控制腹脂性状的主要候选基因.

鸡类胰岛素生长因子-Ⅱ基因单核苷酸多态与生长、屠体性状相关性的研究

以鸡类胰岛素生长因子 -Ⅱ (IGF -Ⅱ )基因作为控制鸡生长、屠体性状主基因的候选基因 ,以明星肉鸡和丝毛乌骨鸡杂交产生的F2 代鸡群为实验材料。通过PCR -RFLP方法对IGF -Ⅱ基因进行多态性检测。在该基因外显子 2中发现一处碱基突变 ,可由内切酶Aci-Ⅰ酶切证实 ,但未导致氨基酸改变。对F2 鸡群个体进行了基因型鉴定 ,结果经方差分析显示 :该基因对一些生长、屠体性状有显著性影响 (如胸角宽、腺胃重、半净膛重等 )。表明该基因可能调控鸡生长、屠体性状的表达 ,或与控制生长、屠体性状的主基因连锁。

生物医药中的转基因动物研究与开发

回顾了动物转基因技术的发展 ,总结了转基因动物在生物医药领域中的研究与开发现状 ,特别是利用动物乳腺生物反应器生产人药用蛋白和营养保健蛋白、异种动物器官移植以及转基因动物疾病模型方面的产业化进程 ,同时也预测了一些转基因动物产品的应用前景以及对社会的影响。

电穿孔导入绿色荧光蛋白基因于绵羊胎儿成纤维细胞研究

本文应用质粒pEGFP Cl带有水母绿色荧光蛋白 (GFP)基因和新霉素抗性基因 (Neor)两种报告基因转染胎儿成纤维细胞 ,进行转染条件优化。首先 ,通过成活率确定转染脉冲时程和场强 ,发现有三种组合是最适的组合 ,它们分别为 :时程 5ms,场强 1.2 5～ 1.5kV/cm ;时程 15ms时 ,场强 1.0～ 1.2 5kV/cm ;时程 2 5ms时 ,场强 0 .75～ 1.0kV/cm。接着采用场强 1.2 5kV/cm ,时程 15ms ,研究转染的温度、电导介质、细胞状态、DNA用量和细胞密度对转染效率的影响 ,结果表明电导介质为Dhanks,DNA用量为 4 μg/mL ,对数期细胞密度为 1× 10 6～ 1× 10 7个 /mL ,电击前后在 4℃下各静置 10min时 ,能获得最佳转染效率。

肌肉生长抑制素基因的研究进展

肌肉生长抑制素又称GDF 8,属TGF β 超家族,是骨骼肌生长的负调控因子。最早在小鼠中发现该基因的突变可导致骨骼肌肥大。随后的研究表明 ,肉牛的双肌现象也是该因子外显子311bp的碱基缺失或保守的单个碱基的突变所造成的。对人肌肉生长抑制素基因的研究表明 ,它包括3个外显子和2个内含子 ,在人的骨骼肌中特异性地表达 ,产物为成熟糖蛋白。目前 ,该基因已分别在人、牛和猪的染色体上定位。猪的肌肉生长抑制素基因的表达在仔猪出生时显著下降 ,而且其表达在生后仔猪的乳腺中也可检测到。

藏灵菇源干酪乳杆菌KL1胞外多糖抑制人结肠癌细胞增殖的研究

分离纯化藏灵菇源干酪乳杆菌KL1胞外多糖(EPS),研究EPS纯品对HCT-8人结肠癌细胞的增殖抑制和诱导细胞凋亡作用。利用Sepharose CL-6B凝胶柱探讨干酪乳杆菌KL1菌株EPS粗品的纯化条件,应用紫外全波长扫描及苯酚-硫酸法鉴定EPS纯度;采用CCK-8法和Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒研究EPS对HCT-8人结肠癌细胞的增殖抑制和凋亡作用。结果表明:在0.02～0.12mol/L磷酸盐缓冲液梯度洗脱、流速3mL/min、样品上样质量浓度15.0mg/mL、样品上样量2.0mL的纯化条件下获得EPSa和EPSb两个单一组分的胞外多糖,其纯度分别为91.67%和82.86%。EPSa处理HCT-8人结肠癌细胞体外实验发现,EPSa对HCT-8细胞的增殖有抑制作用,以及诱导细胞凋亡的发生,且细胞生长抑制率呈时间-剂量依赖性。提示藏灵菇源干酪乳杆菌KL1菌株的EPSa有抑制结肠癌细胞增殖的生物活性。

藏灵菇嗜热链球菌胞外多糖对人结肠癌细胞的增殖抑制

探讨从藏灵菇中筛选的嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)所产胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)对人结肠癌HCT-8细胞增殖的影响。采用CCK-8法测定EPS对HCT-8细胞生长的抑制率;形态学观察EPS对HCT-8细胞的杀伤作用;流式细胞术检测EPS对HCT-8细胞周期的影响。结果显示:EPS对HCT-8细胞增殖有明显的抑制作用,且呈时间-剂量依赖性;倒置显微镜下观察部分细胞脱壁、核碎裂、固缩,细胞悬浮坏死;细胞周期分析显示G1期细胞百分率增大。说明EPS通过直接杀伤人结肠癌HCT-8细胞,使细胞周期阻滞于G1期而抑制细胞增殖,从而发挥抗肿瘤作用。

应用微卫星标记分析圈养大熊猫遗传多样性

以来源于成都大熊猫繁育研究基地和中国保护大熊猫研究中心的34只圈养大熊猫(分为a群体和b群体)和7只圈养野生大熊猫(圈养野生群)作为研究对象,利用AY161177～AY161218、Ame-μ5～Ame-μ70和g001～g905等30个微卫星标记对其遗传多样性现状进行分析,并探讨保持圈养大熊猫遗传多样性的方法.微卫星数据表明,30个微卫星标记多态性好(PIC=0.621～0.640),圈养大熊猫遗传多样性水平(a群体:A=5.48,Ho=0.475,He=0.696;b群体:A=5.24,Ho=0.453,He=0.719;圈养野生群:A=3.80,Ho=0.514,He=0.725)高于6个濒危物种(Ho=0.210～0.390,He=0.150～0.430)但低于3个非濒危物种(Ho=0.620～0.710),圈养大熊猫遗传多样性水平都保持在较高水平,但圈养群遗传多样性水平与圈养野生群相比有所降低.F统计量及基因流Nm分析结果证明,a、b两群体间遗传分化程度不高(Nm=2.610,Fst=0.0874,Fit=0.4116),存在个体交换和一定程度的近交,b群体近交程度高于a群体(a群体Fis=0.3221,b群体Fis=0.3983).因此,现阶段圈养大熊猫的管理重点是避免近交和遗传多样性丧失,将圈养大熊猫种群作为同一管理单元,把纠正大熊猫系谱中的错误、科学选择大熊猫个体进行群体间交流作为关键点,利用微卫星技术保持和提高大熊猫种群的遗传多样性水平.

不同化学激活方法对山羊卵母细胞激活效果的研究

激活是体细胞核移植技术的关键步骤。本研究对常用化学激活剂乙醇、钙离子载体A2 3187和离子霉素以及添加 6 二甲基氨基嘌呤 (6 Dimethylaminopurine ,6 DMAP)和放线菌酮 (cycloheximide ,CHX)对山羊卵母细胞的激活效果以及不同卵龄的卵母细胞激活后体外发育效果进行了比较。结果表明 :离子霉素处理组激活率显著高于乙醇和A2 3187处理组 (89.6 %vs 6 3.5 % ,6 8.7% ;P <0 .0 5 ) ;离子霉素 +6 -DMAP处理组激活率显著高于离子霉素 +CHX和离子霉素 +CHX +细胞松弛素D处理组 (90 .1%vs 5 8.9% ,6 3.7% ;P <0 .0 1) ;体外成熟 2 4、2 6、2 8h组桑椹胚率分别为 16 .0 %、2 0 .6 %和 33.3% ,30h组桑椹胚率下降 (13.8% )。以上结果说明 ,在本研究的激活条件下 ,山羊卵母细胞适宜的激活方法为 :成熟起始后 2 8h使用离子霉素和 6 DMAP进行联合激活。

体外培养山羊成纤维细胞系方法的建立

用山羊组织块和0．25％的胰蛋白酶消化培养法获得正常传代细胞，对于出现的上皮样细胞和成纤维样细胞混合生长的问题，则根据两者贴壁紧实程度不同，用0．05％的胰酶-EDTA进行不同时间的消化，将其分离纯化。纯化的成纤维体细胞经数次传代培养后，进行冷冻一解冻检验表明仍具有正常的传代能力。各代体细胞的核型分析表明，在体外培养至20～30代成纤维细胞的细胞形态（为梭形细胞，高度汇合后呈火焰状）、细胞周期以及核型均为正常，符合体细胞克隆转基因的基本要求。

猪肝脏组织表达序列标签(ESTs)的初步分析

构建了猪肝脏组织cDNA文库 ,并对文库中随机挑选的 4 38个克隆的表达序列标签 (ESTs)进行了研究。结果表明 ,在所研究的 4 38个ESTs中 ,186个在猪种中已有匹配序列 ,37个在人类及其它物种中可以找到同源序列 ,2 15个为未知功能基因。试验还测定了文库中 4 5个cDNA克隆的全长插入序列 ,结果表明 ,19个为已知功能基因 ,11个没有发现开放阅读框 ,其它 15个具有开放阅读框 ,但基因的功能未知。这些结果初步代表了肝脏组织的功能基因表达谱。

山羊体细胞转基因方法的探讨

转基因体细胞核移植是制备高效表达转基因动物的主要手段与方法,但由于插入位点、拷贝数不同常使外源基因的表达受到一定影响。本试验以双正向选择标记的pLoxP M为转基因结构,以磷酸钙法、脂质体介导法、电击转染三种方法对山羊胎儿成纤维细胞进行转染。电击(1 70×10-4)和脂质体(1 36×10-4)法明显高于磷酸氢钙法(4 6×10-5),而且三方法的转染效率与细胞类型无关,但电击转染方法简单并适合于不同大小的转基因结构,对长片段更为实用。随机整合的转基因细胞系绿色荧光蛋白的表达水平有很大差异,主要与外源基因的拷贝数和插入位点有关。双正向选择标记不但可以筛选重组体而且可以体外监控外源基因的表达情况,为高表达转基因动物的制备提供了良好的手段与方法。

鸡细胞外脂肪酸结合蛋白基因编码区的单核苷酸多态与腹脂性状的相关研究

以明星肉鸡和丝毛乌骨鸡杂交产生的F2鸡群为实验材料,以鸡细胞外脂肪酸结合蛋白基因为影响鸡脂肪性状的候选基因,对该基因编码区和部分内含子用PCR—SSCP(单链构象多态)法进行单核苷酸多态性检测.其中在检测的内含子中有3处碱基突变;在第5外显子中有一处沉默突变.对鸡腹脂性状进行最小二乘分析,结果表明第9对引物扩增的具有HH型基因片段的鸡与GG,II型相比有较低的腹脂重和腹脂率(P<0.001),表明该基因对于鸡腹脂蓄积具有很大的影响或与控制腹脂性状的主基因连锁.