鸟氨酸脱羧酶基因沉默抑制宫颈癌细胞生长的研究

目的:探讨鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因作为宫颈癌治疗靶基因的可行性。方法:采用慢病毒介导的RNA干扰技术,沉默Hela细胞ODC基因,建立ODC稳定沉默的细胞系Hela/ODC,用定量RT-PCR和免疫印迹检测ODC的表达水平。用MTT实验、克隆形成实验、细胞倍增时间和细胞周期分析评价ODC基因沉默对Hela细胞生长的影响。结果:Hela/ODC的ODC mRNA和蛋白质表达水平均明显下降,mRNA水平下调93.4%。Hela/ODC的增殖受到明显抑制,细胞倍增时间从22.3h延长到32.0h,细胞周期分析S期细胞增加,G0/G1期和G2/M期细胞显著减少。结论:慢病毒载体介导RNA干扰能够稳定沉默ODC基因表达,从而成功抑制肿瘤细胞的生长,表明以ODC基因为靶基因进行宫颈癌的基因治疗是可行的。

人ODC基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建人鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因的RNAi慢病毒载体。方法:根据ODC mRNA序列, 选择3个19nts的靶序列,设计并合成包含各正反义靶序列的互补DNA链,退火后插入pSuper载体的H1RNA启动子后产生pRiODC,将其中的ODC shRNA表达结构酶切插入慢病毒转移质粒pHR' CMVGFP,产生pHRiODC/GFP。与△R8.2和pCMVVSVG共转染HEK293T细胞,包装产生慢病毒,分别采用转导HEK293T细胞和Real-Time RT-PCR的方法测定慢病毒的功能滴度和病毒RNA分子拷贝数。结果:酶切和测序证实,pRiODC质粒构建正确,产生能同时表达GFP和转录产生ODC shRNA的慢病毒转移质粒PHRiODC/GFP,未浓缩及浓缩病毒悬液的功能滴度分别为6.3×104 TU/ml和7×106TU/ml, RNA拷贝数分别为3.4×108copies/ml和3.6×1010copies/ml。结论:成功构建人ODC基因RNAi慢病毒载体,为通过阻断ODC基因表达治疗恶性肿瘤奠定了基础。

前列腺癌的早期信号——IGF-I

前列腺癌是男性易发的疾病，在欧美发病率极高，在高龄男性中仅次于肺癌。我国前列腺癌发病率在逐渐增加。人前列腺特异性抗原（ＰＳＡ）是前列腺上皮分泌的一种糖蛋白。前列腺癌发生时会释放大量ＰＳＡ进入血液，因此测定血清ＰＳＡ在前列腺癌的诊断和治疗后追踪方面有重...

慢病毒shRNA表达载体介导人肿瘤细胞基因稳定沉默的影响因素

目的:探讨慢病毒载体介导人肿瘤细胞RNA干扰的影响因素。方法:用介导RNAi的慢病毒载体Lenti6-HIF1α和Lenti6-HIF1β分别转导人肿瘤细胞系Hela、SPCA1和A549,筛选靶基因稳定表达沉默的细胞株。病毒RNA分子拷贝数和靶基因mRNA水平用实时定量RT-PCR确定。结果:针对不同靶基因的慢病毒转导肿瘤细胞的效率与靶基因无关、存在细胞类型特异性。8h内病毒转导效率与吸附时间呈正关,12h后继续延长吸附时间不能提高转导效率。对靶基因表达的特异性抑制效果与病毒量呈正相关。靶基因稳定沉默细胞株的RNAi效果与细胞类型无关,与靶细胞基因组整合的shRNA表达结构的拷贝数呈正相关。结论:慢病毒载体介导人肿瘤细胞RNA干扰,短期基因抑制效果取决于细胞类型、病毒量和病毒的吸附时间,稳定基因沉默效果与病毒整合到靶细胞基因组的拷贝数相关,筛选稳定基因沉默细胞株时,应尽可能提高病毒量以提高病毒整合的拷贝数。

MCF-7/BCRP细胞系的建立及其生物学特征

目的:建立表达乳腺癌耐药蛋白(BCRP)的耐药细胞系MCF-7/BCRP。方法:提取MCF-7细胞的总RNA,设计BCRP基因上下游引物,用RT-PCR法克隆出BCRP基因全长并连接到真核表达载体pcDNA3.1穴-雪上,转染MCF-7细胞后以G418筛选细胞。采用米托蒽醌外排实验、细胞毒性实验、细胞群体倍增时间、免疫荧光法鉴定构建的耐药细胞系。结果:MCF-7/BCRP对米托蒽醌耐药指数增加至14.72;外排米托蒽醌的作用增强;细胞群体倍增时间较亲代细胞延长;MCF-7/BCRP细胞能表达一定量的BCRP。结论:MCF-7/BCRP细胞能够表达BCRP并具有BCRP的耐药表型。

表达BCRP的卵巢癌耐药细胞系3AO/BCRP的建立及其生物学特征

目的探讨乳腺癌耐药蛋白(BCRP)在卵巢癌中的作用和逆转其介导的MDR,建立表达BCRP的耐药细胞系3AO/BCRP。方法提取MCF-7细胞的总RNA,设计BCRP基因上下游引物,RT-PCR克隆出BCRP基因全长并连接到pcDNA3.1(-)上,转染3AO细胞后以G418筛选存活细胞。采用米托蒽醌外排实验、细胞毒性实验、细胞群体倍增时间、定量PCR、Western blot等方法鉴定构建的耐药细胞系。结果3AO/BCRP对米托蒽醌耐药指数增加至11.58;耐药细胞外排米托蒽醌的作用增强;细胞中BCRPmRNA的水平升高,细胞能表达一定量的BCRP。结论3AO/BCRP细胞具有BCRP的耐药表型,可作为进一步研究BCRP的生物学特性以及建立其介导的耐药逆转模型。

同时针对VEGF和p53腺病毒干扰载体的构建及干扰作用

目的:构建能同时干扰VEGF和p53基因表达的RNAi腺病毒干扰载体,观察其对肿瘤细胞VEGF和p53的干扰作用。方法:先分别构建能干扰p53和VEGF的质粒载体,依次将构建干扰载体的干扰序列和H1启动子序列切下并连接到pAdTrack上,构建成pAdTrack/VEGF/p53,将构建的质粒转染含有pAdEasy-1的BJ5183工程菌中,回收并酶切鉴定重组腺病毒载体,将阳性腺病毒载体感染293细胞并收集病毒,采用荧光定量PCR检测腺病毒干扰载体同时降低VEGF和p53表达的作用。结果:经过酶切鉴定,pad/VEGE/p53载体中含有插入的2个启动子和干扰序列。转染腺病毒干扰载体后,肿瘤细胞中的VEGF和p53 mRNA表达量显著降低。结论:构建能同时干扰VEGF和p53基因的腺病毒干扰载体可以显著降低MCF-7 细胞中VEGF和p53 mRNA的表达。

17β-雌二醇逆转乳腺癌耐药蛋白介导的多药耐药机制

目的探讨17β-雌二醇逆转乳腺癌耐药蛋白(BCRP)介导的非典型多药耐药的机制。方法分别通过药物诱导和转基因的方法建立由BCRP和巨细胞病毒(CMV)启动子启动表达BCRP的两种耐药细胞系MCF-7/MX20和MCF-7/BCRP,将耐药细胞培养在含有17β-雌二醇的培养基中,通过细胞毒性实验,外排实验以及定量PCR观察对不同耐药细胞系的逆转作用。结果培养基中加入17β-雌二醇48h后,MCF-7/BCRP细胞中的米托蒽醌的强度明显低于MCF-7/MX20,MCF-7/BCRP细胞中BCRP mRNA的含量明显高于MCF-7/MX20。17β-雌二醇可以抑制细胞中BCRP的表达和功能,但是不能抑制MCF-7/BCRP细胞中BCRP的表达和功能。结论17β-雌二醇不是作为BCRP的底物而抑制BCRP功能的,而可能是通过调控BCRP基因的启动子发挥作用。

表皮生长因子对前列腺细胞增殖的影响

目的 探讨表皮生长因子(EGF)对前列腺肿瘤细胞PC-3的刺激作用。方法 培养PC-3细胞,试验组分别加入0.5,5,25,50,100ng/ml EGF,对照组不加EGF。继续培养3天,用MTT法测定细胞增殖活性。结果 EGF促进PC-3细胞的增殖,且随EGF浓度升高,细胞增殖活性升高。结论 EGF能促进前列腺细胞的增殖,其含量增高可能与前列腺增生(BPH)的发生有关。

雄激素对人前列腺细胞中鸟氨酸脱羧酶基因表达的调节作用

为探讨雄激素对人前列腺中鸟氨酸脱羧酶（ Ｏ Ｄ Ｃ）基因表达的调节作用，以研究雄激素诱导前列腺良性增生的分子机理，分离培养了人胎儿前列腺间质细胞，以 Ｍ Ｔ Ｔ 法测定不同浓度 Ｄ Ｈ Ｔ对细胞的促增殖作用；以最适浓度的 Ｄ Ｈ Ｔ（１ ０００ μｇ／ Ｌ）刺激该细胞，分别于 ０，３，６，１２，２４，３０ ｈ 提取总 Ｒ Ｎ Ａ，用斑点杂交及 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ 法分析测定各组细胞中 Ｏ Ｄ Ｃ ｍ Ｒ Ｎ Ａ 的丰度，并对杂交膜进行薄层扫描定量．结果显示：（１） Ｄ Ｈ Ｔ 对前列腺间质细胞的增殖呈双相调节作用，即在低浓度时随着 Ｄ Ｈ Ｔ 浓度的增加，对该细胞的促增殖作用增强，１ ０００ μｇ／ Ｌ时刺激活性最强，高浓度 Ｄ Ｈ Ｔ 对该细胞的刺激作用降低．（２）斑点杂交显示，在 １ ０００ μｇ／ Ｌ Ｄ Ｈ Ｔ 刺激细胞后 ６ ｈ 时， Ｏ Ｄ Ｃ ｍ Ｒ Ｎ Ａ开始明显升高，２４ ｈ 达高峰（约为 ０ ｈ 的 ４８ 倍），至 ３０ ｈ 有所降低．（３） Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ 结果显示，人胎儿前列腺间质细胞中有两种 Ｏ Ｄ Ｃ ｍ Ｒ Ｎ Ａ，分别为 ２０ ｋｂ 和 ２６ ｋｂ，经扫描定量结果显示：１ ０００μｇ／ Ｌ Ｄ Ｈ Ｔ 对两种 Ｏ Ｄ Ｃ ｍ Ｒ Ｎ

等位基因3′末端碱基特异性引物定量PCR检测人脂联素基因单核苷酸多态性

目的建立非探针标记荧光定量PCR的SNP检测技术,分析人脂联素(APM1)基因单核苷酸多态性(SNP)与Ⅱ型糖尿病(T2DM)的关系。方法设计3′末端碱基特异性引物,进行定量PCR反应,通过比较各对引物的扩增效率判断基因型,并进行测序验证。利用该方法确定20例T2DM、24例肥胖及28例同年龄组正常人APM1基因的45位和276位碱基的SNP。结果该方法能有效地区分不同的基因型,与测序结果符合率100%。APM1基因45位SNP与T2DM相关(P<0.05),基因型为TT纯合子者发生T2DM的危险性是G/T和GG者的3倍;而肥胖与APM1基因45和276位点SNP无关。结论等位基因3′末端碱基特异性引物定量PCR可以用于基因SNP检测。APM1基因45位碱基的SNP与T2DM发生有关。

雄激素与培养前列腺细胞中鸟氨酸脱羧酶基因表达的关系

为研究雄激素致前列腺良性增生的分子机理，分离培养了人胎儿前列腺间质细胞，并给予ＤＨＴ（１～１００００μｇ／Ｌ）刺激，ＭＴＴ法测定。结果显示，ＤＨＴ对该细胞具有刺激增殖作用，其最适刺激浓度为１０００μｇ／Ｌ。斑点杂交结果显示，鸟氨酸脱羧酶（ＯＤＣ）ｍＲＮＡ的表达在ＤＨＴ（１０００μｇ／Ｌ）刺激６ｈ时开始升高，２４ｈ时达高峰，３０ｈ时有所降低。提示雄激素刺激前列腺间质细胞增殖的分子机理部分是通过刺激前列腺间质细胞的ＯＤＣ基因表达来完成的。

EGF对前列腺细胞中鸟氨酸脱羧酶基因表达的调控

目的 :探讨EGF诱导前列腺增殖的分子机理。方法 :以MTT法测定不同浓度表皮生长因子(EGF)对前列腺癌细胞PC 3的促增殖作用 ;以最适浓度EGF(5 0ng/ml)刺激该细胞 ,分别于 0、1、3、6、12、2 4h提取总RNA ,用斑点杂交法分析测定各组细胞中ODCmRNA丰度 ;用免疫组化及流式细胞术两种方法检测EGF刺激细胞后ODC蛋白表达量的变化。结果 :①EGF能促进PC 3细胞的增殖 ,而且随着EGF浓度的升高 ,细胞增殖活性增加 ;②斑点杂交显示 ,EGF刺激细胞后 3h ,ODCmRNA开始明显升高 ,12h达高峰 (约为 0h的 3.6 6倍 ) ,至 2 4h时有所降低 ;③免疫组化及流式细胞术检测显示 ,EGF刺激细胞 3d后ODC蛋白阳性细胞表达率明显升高。结论

前列腺特异抗原(PSA)启动子组织特异性鉴定

目的构建前列腺特异的PGL3-LUC表达载体,观察报告基因的表达情况以验证其组织特异性。方法经过改造的高效前列腺特异抗原(PSA)启动子全序列经酶切亚克隆入pGL3-basic荧光素酶报告基因载体,重组载体pGL3-psa转染前列腺癌细胞(Du-145)和肠癌细胞(HT-29),并应用双荧光素酶检测系统检测荧光素酶活性,排除转染过程误差。结果转染重组载体pGL3-psa诱导前列腺癌细胞荧光素酶活性明显增强,而空载体pGL3-basic和肠癌细胞的荧光素酶表达处于基础水平,比较差异有显著性意义P<0.05。结论构建的经过改造的高效前列腺特异抗原(PSA)启动子的荧光素酶报告基因载体,转染前列腺癌细胞后能够表达荧光素酶蛋白,具有组织特异性。

在创新教育中培养研究型教师的思考

随着教学改革的不断深化,全面实施以培养学生的创新精神和实践能力为重点的素质教育已成为教育界的共识。素质教育的重点是实施创新教育,创新教育对教师的素质提出了更高的、全方位的要求,并向传统的“传道、受业、解惑”的教师观提出了挑战。笔者认为,要把这一全新的教育理念带进课堂,指导教学,培养高素质人才,以适应时代发展的新要求,教师除了具有扎实的专业知识和综合性知识外,还必须树立“教育即科学”的观点,坚持走“研究型”的创新之路。

趋化因子受体CCR4、CCR5在系统性红斑狼疮患者外周血CD4^+T淋巴细胞上的表达及其意义

目的探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者趋化因子受体CCR4和CCR5在外周血淋巴细胞表面的表达及其意义。方法流式细胞仪计数法对113例SLE患者和50例健康体检者外周血淋巴细胞表面CCR4和CCR5的表达情况进行检测,分析及评价SLE患者外周血淋巴细胞中CCR4+和CCR5+T淋巴细胞的百分数。结果非狼疮性肾炎(nLN)SLE组外周血CCR4+CD4+T%明显高于健康对照组(P<0.01);狼疮性肾炎SLE组外周血CCR4+CD4+T%明显高于健康对照组(P<0.001);LNSLE组外周血CCR4+CD4+T%明显高于nLNSLE组(P<0.01);nLNSLE组外周血CCR5+CD4+T%高于健康对照组(P<0.05);LNSLE组外周血CCR5+CD4+T%明显高于健康对照组(P<0.001);LNSLE组外周血CCR5+CD4+T%明显高于nLNSLE组(P<0.01)。SLE活动组血清CCR4+CD4+T%与CCR5+CD4+T%较非活动组和对照组明显升高(P<0.01);活动性狼疮性肾炎(LN)与活动性无肾损伤组及对照组比较,其差异具有显著统计学意义(P<0.01)。nLNSLE组外周血CCR4+CD4+T%与CCR5+CD4+T%有相关性(r=0.619,P<0.05);LNSLE组外周血CCR4+CD4+T%与CCR5+CD4+T%有明显相关性(r=0.68,P<0.01);血清CCR4+CD4+T%水平随着SLE疾病活动水平明显升高,与总的系统性红斑狼疮疾病活动性指数(SLEDAI)评分密切相关(r=0.6382,P<0.001);与SLEDAI肾评分亦密切相关(r=0.6980,P<0.001);而CCR5+CD4+T%与疾病活动度不相关(r=0.16,P>0.05)。结论以上结果表明CCR4和CCR5在T细胞趋化至病变部位的过程中可能发挥重要作用,CCR4+CD4+T%与CCR5+CD4+T%可能在肾损伤中起着十分重要的作用,血清CCR4+CD4+T%、CCR5+CD4+T%与SLE疾病活动密切相关,可作为SLE疾病活动,尤其是监测狼疮性肾损伤的重要指标。