A群猪轮状病毒VP7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

试验旨在制备A群G11血清型猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)VP7蛋白的单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性。将A群G11血清型PoRVVP7基因克隆至pGEX-6P-1载体,然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,IPTG诱导表达GST-VP7融合蛋白。分离纯化融合蛋白GST-VP7并免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,利用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞并进行有限稀释法克隆化筛选。经3次筛选,最终得到1株能与GST-VP7蛋白反应的特异性、稳定分泌抗体的阳性细胞克隆。Western blotting鉴定结果显示该单克隆抗体具有良好的免疫原性及特异性;MTT法中和试验结果显示其具有中和活性;分泌的单克隆抗体亚型为IgG2b。本试验结果表明A群PoRV VP7蛋白在大肠杆菌中成功表达且制备了单克隆抗体,可用于PoRV VP7蛋白结构和功能的研究,也为猪轮状病毒病的预防、诊断和治疗等研究奠定基础。

VeroE6细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为寻找与猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）相互作用的VeroE6细胞蛋白，深入研究病毒感染机制，本试验建立了一个VeroE6细胞酵母杂交cDNA文库。采用Trizol试剂从培养的VeroE6细胞中提取细胞总RNA，通过SMART技术合成双链cDNA，并利用同源重组的方法构建VeroE6细胞的酵母cDNA文库。结果显示，文库滴度为9．7×10^8 CFU／mL，插入的双链cDNA片段大小为0．5～3kb，平均长度约为1．6kb，文库重组率为87％，此文库可以用来筛选与病毒相互作用的VeroE6蛋白。该文库的构建为发现和研究与PEDV结构蛋白相互作用的宿主细胞蛋白奠定基础。

抗猪传染性胃肠炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位的鉴定

为制备抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究利用原核表达系统表达重组N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,将其脾细胞与骨髓瘤细胞融合,通过间接ELISA方法筛选阳性克隆,经4次细胞克隆纯化后,获得两株稳定分泌抗重组TGEV N蛋白的MAb,命名为3D7和5E8。通过western blot和间接免疫荧光试验对MAb的免疫活性和特异性进行鉴定,结果表明两株MAb均能够与TGEV全病毒反应并且特异性良好。利用合成的多肽对N蛋白抗原表位进行鉴定,初步确定MAb 3D7识别的表位为241AGKGDVTRFYGARSSSANFG260;5E8为184NKKDDSVEQAVLAALKKLGV203。本研究制备了两株MAb并对其表位进行鉴定,为TGEV检测方法的建立和N蛋白功能的分析奠定了基础。

猪A群轮状病毒VP6蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定

为制备猪A群轮状病毒(RV)VP6蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究以原核表达、纯化的重组VP6蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,r VP6-GST为包被抗原,通过间接ELISA筛选出一株稳定分泌抗VP6蛋白的MAb杂交瘤细胞株(1F4)。MAb鉴定结果显示其抗体亚类为Ig G1型,轻链为κ链;细胞上清液及腹水效价分别为1∶12 800和1∶106。Western blot和间接免疫荧光结果显示该MAb能够与天然的VP6蛋白反应。应用肽扫描技术鉴定显示该MAb对应抗原表位核心序列为134DYIENWNLQNR144。该MAb的制备为进一步研究VP6蛋白功能和建立RV检测方法奠定基础。