欧洲葡萄VvJAZ9基因互作蛋白的筛选与验证

【目的】探究葡萄JAZ家族基因特点及在低温胁迫下的表达情况,以期筛选出与低温胁迫相关的家族成员,并进一步筛选其互作蛋白,为后续葡萄抗寒机制研究提供理论依据。【方法】以拟南芥和葡萄基因组数据为基础,获得葡萄JAZ家族成员基因并进行同源克隆、染色体定位、理化性质以及蛋白家族聚类等分析,利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术分析VvJAZ家族成员基因在低温胁迫下的表达情况,应用酵母双杂交技术进行互作蛋白筛选和验证,并通过双分子荧光互补试验验证候选互作蛋白与VvJAZ9蛋白的互作关系。【结果】葡萄中有11个JAZ家族基因,随机分布于7条染色体上,都具有JAZ家族蛋白中特有且高度保守的TIFY和Jas结构域,均属于碱性不稳定亲水蛋白;聚类分析表明,葡萄JAZ家族蛋白可分为3个亚族,其中VvJAZ9与拟南芥AtJAZ1和AtJAZ2的亲缘关系最近,VvJAZ1与VvJAZ11、VvJAZ5与VvJAZ6同源关系最近。qRT-PCR结果表明,VvJAZ9是葡萄JAZ家族成员基因中受低温诱导表达最为明显的1个基因。通过酵母双杂交试验筛选获得26个可能与VvJAZ9存在互作关系的候选蛋白;通过q RT-PCR分析候选蛋白的相关基因在低温胁迫下的表达模式,结果表明HAP5A基因受低温诱导表达趋势与筛选出的VvJAZ9基因类似,推测HAP5A可能是JAZ9候选互作蛋白中响应低温最为显著的1个蛋白;通过同源克隆获得了VvHAP5A基因序列,全长636 bp,编码211个氨基酸,进一步分析发现该基因是NF-YC类型的转录因子,通过酵母双杂交和双分子荧光互补试验也证实了JAZ9与HAP5A蛋白全长有互作关系。【结论】鉴定并克隆到了葡萄的11个VvJAZs基因,VvJAZ9和VvHAP5A基因均响应葡萄低温诱导表达,并且二者还具有蛋白互作关系,可为进一步研究葡萄JAZ基因参与低温胁迫的机制提供参考。

葡萄VvGAI1与VvJAZ9蛋白互作及低温下的表达模式分析

【目的】DELLA蛋白属于植物特有的GRAS蛋白家族,是赤霉素信号转导途径中的重要调控因子,在植物生长发育和抵御逆境胁迫中发挥着重要作用。克隆欧洲葡萄VvGAI1,并对其进行亚细胞定位、蛋白互作和表达分析,为进一步研究DELLA蛋白在葡萄抗寒反应中的调控功能奠定基础。【方法】以酿酒葡萄品种‘霞多丽’叶片为试材,采用同源克隆的方法获得VvGAI1序列。利用生物信息学方法分析该基因的序列特征,使用DNAMAN及MEGA7.0对VvGAI1蛋白序列及拟南芥序列进行多序列比对并构建系统进化树。通过亚细胞定位确定VvGAI1蛋白在细胞中的表达位置;利用酵母试验验证VvGAI1蛋白的转录激活活性;利用酵母双杂交和双分子荧光互补试验验证VvGAI1蛋白与VvJAZ9蛋白的互作关系;利用VvGAI1原核表达蛋白制备anti-VvGAI1兔源多克隆抗体;利用Western Blot技术检测VvGAI1蛋白在低温下的表达情况;通过相对电导率分析外源喷施茉莉酸和赤霉素对葡萄抗寒性的影响。【结果】从‘霞多丽’叶片中克隆得到VvGAI1,其ORF为1773 bp,编码590个氨基酸,位于第1条染色体,含有1个外显子,无内含子。VvGAI1蛋白相对分子质量为64.87 kDa,理论等电点p I为5.31,属于酸性不稳定亲水蛋白。VvGAI1具有高度保守的DELLA和GRAS结构域,属于植物GRAS家族的DELLA蛋白。蛋白聚类分析显示VvGAI1与拟南芥AtGAI和烟草Nt GAI1亲缘关系较近。亚细胞定位与转录自激活结果显示VvGAI1是一个定位于细胞核中且具有转录激活活性的转录因子。酵母双杂交和双分子荧光互补试验也证实VvGAI1与VvJAZ9具有互作关系。将VvGAI1克隆至原核表达载体构建pET28b-VvGAI1重组表达载体,转化至大肠杆菌BL21中经16℃、1.0 mmol·L^(-1)异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得VvGAI1-His融合蛋白,再经抗原免疫,血清纯化后制备得到anti-VvGAI1兔源多克隆抗体。制备的anti-VvGAI1抗体可以特异性检测‘霞多丽’葡萄中的VvGAI1蛋白。Western Blot结果表明,低温处理下葡萄原生质体中VvGAI1蛋白呈先上升后下降的表达趋势,VvGAI1蛋白响应低温诱导表达。与对照相比,50μmol·L^(-1)茉莉酸甲酯(Me JA)处理可以提高葡萄的抗寒性,50μmol·L^(-1)赤霉素(GA3)处理使葡萄对寒冷变得敏感。【结论】葡萄VvGAI1是一个与VvJAZ9相互作用的转录因子,VvGAI1对低温胁迫有响应,外源茉莉酸能够正调控冷胁迫反应,而赤霉素负调控冷胁迫反应。