利用定点突变研究CCR5膜外襻上与HIV gp120结合的关键残基

目的:研究CCR5在作为Ⅰ型人类免疫缺陷病毒(HIV-Ⅰ)进入细胞的辅助受体时,发挥关键作用的氨基酸。方法:通过定点突变对CCR5膜外各襻上的某些氨基酸进行突变,将非极性氨基酸变为极性氨基酸,疏水氨基酸变为亲水氨基酸,芳香族氨基酸变为非芳香族氨基酸,通过将其与gp120分别表达,进行结合实验,寻找与病毒结合活性降低的突变型。结果:当CCR5膜外第一襻用Tyr替代Cys,第三襻用Ser替代Pro后,CCR5与病毒表面糖蛋白gp120的结合活性极大降低。而对其他膜外襻上的氨基酸进行突变后,结合活性无明显改变。结论:病毒进入受体细胞需要受体和辅助受体的介导。CCR5作为辅助受体,主要是通过膜外特定的氨基酸与病毒的gp120发生识别,寻找到这些识别氨基酸就可以为AIDS的预防和治疗提供一定的靶点。

重组人胸腺素原α在大肠杆菌中的表达优化

在 1 5L的生物反应器内 ,对重组人胸腺素原α(huPTMAα)在大肠杆菌TG 1中经IPTG诱导后的表达条件进行优化 ;应用NBS MICROS 1 5L T DR型生物反应器 (1 5L) ,用工程菌E colipGEX IN/PTMA ,研究了诱导时不同的pH、温度、搅拌速率和IPTG浓度 ,利用正交试验对发酵条件进行了优化。经 1次预试验和 9次正式试验结果表明 ,huPTMAα的表达受溶氧条件的影响较显著 ,其中搅拌速率和通气量为最大的影响因子 ,当其为 2 5 0r/min时 ,表达水平最高。经SDS PAGE和凝胶扫描发现表达蛋白占菌体蛋白的 60 %以上。该实验为工程菌的中试提供了最佳的表达诱导条件 ,对其稳定性 。

胸腺素а原的生物学活性及基因表达谱芯片分析

目的 :对一个新的胸腺素α原 (human prothymosinα,Pro Tα)进行生物学活性研究及基因表达谱分析。 方法 :用体外刺激小鼠脾细胞增殖进行实验及 EL ISA法检测 Pro Tα对 IL - 2和 TNF-α的诱导分泌作用 ,并用基因芯片技术对其表达谱进行分析。结果 :Pro Tα对小鼠脾细胞有明显的促进增殖作用 ,对 IL - 2和 TNF-α有明显的诱导分泌作用 (P<0 .0 1)。基因芯片研究发现 Pro Tα对蛋白酪氨酸磷酸酶基因、淋巴细胞抗原 6复合体、增殖相关基因 A等的表达有上调作用。 结论 :该新型Pro Tα在体外实验中有免疫调节活性 ,并诱导一些基因的表达。

人趋化因子受体5N端膜外第一襻的克隆与表达及其特异抗体的制备

目的:获得人β趋化因子受体5(huCCR5)N端膜外第一襻基因片段的序列,并构建表达huCCR5 N端膜外第一襻的重组体,实现其有效表达及其特异抗体的鉴定。方法:计算机分析比较趋化因子超家族部分成员,定位超家族中同源性最低的N端膜外第一襻结构域。PCR扩增出该结构域114个核苷酸序列基因片段,构建融合表达载体pGEX-IN/NR5,经测序确定基因片段正确后,在大肠杆菌中表达。表达产物经纯化后免疫新西兰兔。ELISA鉴定CCR5 N端肽段特异性抗体。结果:序列测定结果与文献报道一致,经计算机作图分析ELISA实验数据证明得到抗huCCR5 N端肽段的特异性抗体。结论:本方法采用pGEX-lN在大肠杆菌DE3中有效表达CCR5 N端膜外第一襻基因片段,并实现了对其特异性抗体的鉴定,为进一步的研究奠定基础。

克隆人胸腺素α原cDNA及RNA二级结构分析和带Xa因子的融合表达

目的：克隆表达具有重要生物功能的胸腺素α原ｃＤＮＡ（ｈｕｍ ａｎ ｐｒｏｔｈｙｍ ｏｓｉｎα， ｈｕＰＴＭＡα）。方法：从健康中国人ＰＢＭＣｐｏｌｙ（Ａ）＋ ＲＮＡ中采用ＲＴ－ＰＣＲ法克隆ｈｕＰＴＭＡαｃＤＮＡ，并作ＲＮＡ二级结构分析。结果：克隆出长度为３００ ｂｐ，编码１００ 个氨基酸的ｈｕＰＴＭＡαｃＤＮＡ，经氨基酸序列分析发现在３７～４１ 位缺失Ａｓｎ３７ －Ｇｌｙ３８ －Ａｓｎ３９ －Ａｌａ４０－Ｇｌｕ４１ 和６５～６８ 位缺失Ｇｌｕ６５－Ｇｌｕ６６ －Ｇｌｕ６７ －Ｇｌｕ６８ ，与国际基因库连接检索证明是与ｈｕＰＴＭＡα有８６．４％ 同源性的一个新亚型，融合表达蛋白的相对分子质量为３．７×１０４，有促进ＩＦＮ和ＴＮＦ产生的生物学活性。结论：本研究克隆的ｈｕＰＴＭＡαｃＤＮＡ是中国人中新发现的一个多态型基因序列，它的克隆并表达成功为今后该基因的免疫功能研究及中国人基因型研究分析提供了有用的材料。

重组人胸腺素α原体外对IFN-γ,IFN-α及TNF-α的影响

目的 体外观察重组人胸腺素α原 (prothymosinα ,ProTα)对几种重要细胞因子分泌的影响。方法 用脾淋巴细胞、脾巨噬细胞及腹腔巨噬细胞 ,以ELISA法检测ProTα对IFN γ ,IFN α和TNF α分泌的影响。结果 1× 10 - 7mol·L- 1 ProTα明显促进脾细胞分泌IFN γ(P <0 0 5 ) ,该浓度的ProTα也明显刺激小鼠脾巨噬细胞分泌IFN α(P <0 0 1) ;在小鼠腹腔巨噬细胞中 ,ProTα能明显刺激IFN α和TNF α的分泌 (P <0 0 1)。结论 ProTα对细胞因子IFN γ ,IFN α和TNF α的分泌均有促进作用。

重组人胸腺素α原生物活性的体外研究

目的 对本室克隆并表达的一种胸腺素α原 (humanprothymosinα ,ProTα)的生物活性进行体外实验研究。 方法 体外对其促进E 玫瑰花结形成率 ,在ConA存在下及单独使用ProTα对小鼠胸腺细胞的促增殖作用 ,以及对细胞活素IL 2 ,IFN γ的促诱生作用进行检测。结果 在高浓度时 (1× 10 -7mol·L-1) ,对人外周血单核细胞E 玫瑰花结形成的激活率可达 5 2 .7%。无论有无ConA ,1× 10 -7,1× 10 -8mol·L-1的ProTα明显刺激小鼠胸腺细胞增殖 (P <0 .0 1) ;此外 ,一定浓度的ProTα能促进IL 2 ,IFN γ的分泌 (P <0 .0 5 )。结论 ProTα具有明显刺激小鼠胸腺细胞增殖和促进IL 2 ,IFN

一种新的胸腺素α原cDNA

目的 :我们克隆了有中国人特征的胸腺素 α原 (prothymosinα,PTMAα)全长 c DNA,并进行测序分析。方法 :从健康中国人 PBMC po1y(A) + RNA中采用 RT- PCR法克隆 hu PTMAα c DNA,酶切鉴定 ,序列分析。结果 :经测序后发现该基因是一个与国外的高加索人种胸腺素 α原有 86 .4%同源性的新基因。结论 :从中国人中新发现了一个 hu PTMAα基因 ,并于日前被美国 NCBI(National Center of Biotechnology Inform ation) Gen Bank收入 ,获得登录号 (Accession:AF170 2 94)

人CCR55′侧翼调控序列克隆测定及基序分析

目的 :克隆人 CCR5 5′侧翼调控序列及其基序分析。方法 :设计单引物 ,利用单向多循环 PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化人 CCR5 5′侧翼调控序列基因组 DNA,PCR产物作为序列分析模板。 结果 :得到长为 1.5 kb的人 CCR5 5′侧翼调控序列基因组 DNA序列 ,并对该区域的基序进行了分析。结论 :该方法适合于基因组 DNA,特别是逆向扩增一些读框区 5′侧翼调控序列。

人单核细胞趋化蛋白受体5的基因克隆及该基因超家族成员氨基酸结构分析(英文)

目的 :获取有重要生物功能的人单核细胞趋化蛋白受体 5 (hum an m onocyte chemotactic receptor5 ,hu CCR5 )。方法 :从人 PBMC中提取总 RNA和 poly(A) + RNA,而后经反转录合成 c DNA第一链 ,再以 PCR扩增出 hu CCR5 c DNA并插入融合表达载体 pc DNA3.0的 Bam H 和 Hind 位点 ,转化大肠杆菌 TG- 1,挑取克隆 ,酶切鉴定 ,序列分析。结果 :克隆出长度为 10 5 6 bp,编码 35 2个氨基酸的 hu CCR5 c DNA。并分析证明与该基因超家族氨基酸有 80 %同源性 ,与国外发表资料比较有3个碱基突变。 结论 :克隆出人单核细胞趋化蛋白 5受体 ,为今后基础研究提供了较有用的材料。

Effect of monocyte chemoattractant protein-1 on chemotactic gene expression by macrophage cell line U937

Objective: To study the chemotactic superfamily genes expression profiling of macrophage line U937 treated with monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) using gene chip technique. Methods: Total RNA from macrophage line U937 (as control) and U937 with MCP-1 was extracted, made reverse transcript to cDNA and tested with gene expression chip HO2 human. Results: Some chemotactic-related gene expressions were changed in all analyzed genes. Regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted (RANTES) was up-regulated over 2-fold and 7 chemotactic-related genes (CCR2, CCR5, CCL16, GROβ, GROγ, IL-8 and granulocyte chemotactic protein 2) were down-regulated over 2-fold in MCP-1 treated U937 cells at mRNA level. Conclusion: MCP-1 can influence some chemokines and receptors expression in macrophage in vitro, in which MCP-1 mainly down-regulates the chemotactic genes expression of those influencing neutrophilic granulocyte (GROβ, GROγ, IL-8 and granulocyte chemotactic protein 2). Another novel finding is that it can also down-regulate the mRNA level of CCR5, which plays a critical role in many disorders and illnesses.

Sequence of a new prothymosinα cDNA

Objective:To clone prothymosin α which has important biological functions and to analyze its sequence. Methods:huPTMA α cDNA was cloned from poly(A) + RNA of the healthy Chinese peripheral blood monocyte cells by RT-PCR and the sequence was analyzed. Results:It was a new subtype of huPTMA α and has 86.4% homology with Genbank data. Conclusion:We find a new gene from the healthy Chinese, and it is named and accepted by Genbank.

趋化因子CXCL13及其受体CXCR5研究进展

趋化因子及其受体是免疫系统的重要组成部分 ,通过它们之间的信号传导 ,使得免疫系统正常运作。根据其结构特征 ,趋化因子及其受体被分为C、CC、CXC、CX3 C四个家族 ,本文将介绍近两年对CXC家族的趋化因子CXCL13的结构特征、表达调控、与细胞因子家族其它成员之间的相互作用 ,以及它与相应的配体CXCR5结合后所介导的生理和病理作用等方面研究的一些进展 。