逆转录病毒载体介导骨髓基质细胞体外表达人凝血因子Ⅷ

目的 探索骨髓基质细胞用于血友病A基因治疗的可能性。方法 采用一包含了B区缺失 (△ 76 0aa～ 16 39aa)的人凝血因子ⅧcDNA(FⅧ△BcDNA)的复制缺陷型重组逆转录病毒LNC FⅧ△B ,在低温 (32℃ )和离心等改进条件下转化体外分离培养的小鼠和兔骨髓基质细胞。分别采用一期法、ELISA法和半定量PCR方法检测细胞培养上清中人FⅧ的凝血活性 (FⅧ :C)和抗原含量 (FⅧ :Ag)以及骨髓基质细胞的基因转化效率。并对转化细胞表达的FⅧ蛋白进行Westernblot分析。结果 与标准方法相比 ,离心和 32℃转化使小鼠骨髓基质细胞的基因转染效率提高 5 0 %～ 80 %。转化后的小鼠和兔骨髓基质细胞分泌的人FⅧ :Ag分别为每 2 4h(5 5 6± 80 )ng/ 10 6细胞和每 2 4h(4 80± 5 6 )ng/ 10 6细胞 ,FⅧ :C分别为每 2 4h 2 .42U/ 10 6细胞和 1.8U/ 10 6细胞。Westernblot分析显示 ,骨髓基质细胞分泌缺失B区的FⅧ蛋白 (FⅧ △ 760～ 163 9aa)与正常人血浆中的野生型FⅧ相似 ,主要以重 轻链异二聚体形式存在。结论 转化后的骨髓基质细胞可以高效分泌人FⅧ ,结合离心和低温对方法的改进 。