基于大肠杆菌K-12MG1655的narG基因缺失荧光工程菌的构建

本研究应用PCR扩增两翼与靶基因上下游同源含有Cmr(氯霉素抗性基因)的片段,经电击转化至E.coli K-12 MG1655中。在λRed重组系统的帮助下,通过氯霉素抗性基因两侧的同源序列在体内与narG基因发生同源重组,随后利用Cmr两端的FTP位点,通过FLP酶专一性重组将Cmr删除,获得narG基因精确敲出且不带Cmr的E.coli K-12 MG1655(ΔnarG)突变株。最后转化NO诱导的GFP(绿色荧光蛋白基因)报告基因质粒p SB1C3_BBa_K 381001,获得具有对(亚)硝酸盐荧光应答的重组发光工程菌株K-12 MG1655(ΔnarG)::GFP。生长曲线测定结果表明,narG基因的敲出对大肠杆菌正常生长无显著影响(p>0.05)。荧光工程菌对(亚)硝酸盐的应答结果表明,E.coli K-12 MG1655(ΔnarG)::GFP对(亚)硝酸盐的敏感性相对于E.coli K-12 MG1655::GFP提高了2.5倍左右。且在0~8μmol/L的硝酸盐浓度下符合线性关系:(R2=0.968 3);在0~4μmol/L的亚硝酸盐浓度下符合线性关系:(R2=0.997 5)。本研究所构建的E.coli K-12 MG1655(ΔnarG)::GFP能够有效检测痕量(亚)硝酸盐,可为检测食品和水质中(亚)硝酸盐提供新的方法选择。

苦荞转录因子基因FtMYB21的克隆及其非生物胁迫下的表达分析

MYB转录因子是植物最大的转录因子家族之一,广泛参与植物各种生理生化过程。本研究根据苦荞花期转录组数据,筛选得到一条与拟南芥At MYB1同源性高的序列,采用RT-PCR技术克隆得到该基因,命名为Ft MYB21。生物信息分析表明,该基因编码蛋白含364个氨基酸,相对理论分子量40.0 k D,理论等电点p I 5.79。多重序列比对表明,其编码蛋白属于典型的R2R3型MYB转录因子。进化树分析表明,Ft MYB21蛋白与拟南芥参与抗逆的At MYB1聚为一簇。荧光定量PCR分析表明,Ft MYB21在高盐胁迫下表达量持续显著上升,72 h时达最大值,为对照组的3.35倍;在PEG干旱胁迫下该基因表达量迅速上调,6 h后趋于稳定,为对照组的1.8倍。因此,Ft MYB21基因可能参与苦荞抗高盐和干旱等非生物胁迫的应答反应,这为进一步理解苦荞的抗逆生理奠定了基础。

苦荞转录因子基因FtDREB1和FtDREB2的克隆及其对非生物胁迫的应答

基于苦荞（Fagopyrum tataricum）花期转录组数据,采用RT-PCR技术克隆到2个编码DREB类转录因子的基因,命名为Ft DREB1和Ft DREB2。氨基酸多重序列比对表明,其编码蛋白Ft DREB1和Ft DREB2具有与拟南芥DREB相同的保守AP2结构域。进化树分析表明,Ft DREB1和Ft DREB2与抗逆相关DREB转录因子归为A2亚家族。实时荧光定量PCR分析表明,在PEG模拟的干旱胁迫下,Ft DREB1和Ft DREB2表达量有所上升,峰值分别在2 h与12 h,分别为对照组的2.09倍（p〈0.01）和2.83倍（p〈0.01）;低温与Na Cl胁迫下,Ft DREB1和Ft DREB2表达量均显著下降,趋势基本一致。本研究推测Ft DREB1和Ft DREB2基因以相似的应答模式参与了苦荞对不同非生物胁迫的应答过程。