华支睾吸虫乳酸脱氢酶E_(10-20)及E_(94-102)表位的克隆表达与生物学特性初步研究

【目的】原核克隆及表达华支睾吸虫乳酸脱氢酶(CsLDH)两个表位aa10-20(E10-20)及aa94-102(E94-102),初步研究两表位与CsLDH免疫学及酶学相互关系。【方法】将E10-20及E94-102克隆至pGEX-4T-1载体,表达纯化重组蛋白,用Western Blotting和间接ELISA法检测CsLDH免疫血清对表位重组蛋白的识别,同时检测两表位重组蛋白的免疫血清对CsLDH蛋白的识别;利用CsLDH标准酶活性反应体系,比较两表位免疫血清与CsLDH免疫血清对CsLDH催化丙酮酸还原成乳酸反应的影响。【结果】成功构建pGEX-4T-1-E10-20及pGEX-4T-1-E94-102重组质粒,SDS-PAGE鉴定表达的重组蛋白,菌体裂解液经亲和层析纯化,获得与GST融合表达的蛋白E10-20及E94-102。两表位重组蛋白均可被CsLDH免疫血清识别,而对E94-102更易于识别;重组CsLDH也能被E10-20及E94-102免疫血清识别,而不能被对照血清识别。E94-102免疫血清能抑制CsLDH催化丙酮酸还原成乳酸的反应。【结论】表位结构和功能研究深化了对CsLDH结构的理解,并为开辟CsLDH疫苗研究新路径奠定基础。

时间分辨荧光免疫分析技术在寄生虫病诊断中的应用

时间分辨荧光免疫分析(Time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)是一种新型的体外超微量分析技术,被公认为是目前灵敏度最高的分析方法之一,并以其独特的优势近些年迅速发展,已延伸至生物医学、临床医学研究的各个领域。本文就该技术的研究进展及在某些寄生虫病检测诊断中的相关应用作一简要综述。

华支睾吸虫LAP2基因的生物信息学分析及克隆表达、组织定位

目的利用生物信息学方法分析华支睾吸虫LAP2全长基因的结构和功能,并将该基因克隆至原核表达载体进行表达、纯化,为进一步研究LAP2功能奠定基础。方法利用生物信息学相关软件,分析华支睾吸虫LAP2基因及其蛋白的结构、生物学和免疫学功能特征。针对LAP2的EST序列的编码区设计引物,从华支睾吸虫囊蚴cDNA质粒中扩增目的基因,克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,经PCR、双酶切及DNA测序鉴定的阳性克隆诱导目的蛋白表达、亲和层析纯化、免疫印迹鉴定及组化定位。结果华支睾吸虫LAP2基因全长为1761bp,其编码序列长度为1662bp,编码553个氨基酸,理论分子量是59696.5Da,与人的该基因氨基酸序列相似性为26.7%,一致性仅为15.4%。该基因在大肠杆菌中可被高效表达,纯化的重组蛋白能被感染华支睾吸虫的大鼠血清识别,免疫组化结果表明该重组蛋白定位于华支睾吸虫成虫的肠支及表膜。结论华支睾吸虫LAP2在大肠杆菌中呈高效的可溶性表达,具有良好的抗原活性,可能为华支睾吸虫成虫分泌排泄抗原的组份之一。

华支睾吸虫钙调理蛋白的克隆表达、组织定位及功能的初步研究

目的克隆和原核表达华支睾吸虫钙调理蛋白(CsCALP),并初步研究其功能及免疫学意义。方法利用生物信息学相关软件分析CsCALP蛋白的基本理化特征和三维结构;将CsCALP基因克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,诱导表达CsCALP蛋白并用镍离子亲和层析柱进行纯化;通过凝胶覆盖(Gel overlay)试验鉴定纯化的CsCALP蛋白与F-Actin的结合能力;使用纯化的CsCALP蛋白免疫SD大鼠,获得抗血清,通过Western blot分析其免疫学特性;应用免疫荧光化学法观察华支睾吸虫CsCALP蛋白在成虫的定位。结果 CsCALP基因编码序列长度为1086bp,编码361个氨基酸,理论分子质量单位为39.7708ku,具有1个calponin homology结构域和5个calponin-like repeat结构域;该基因在大肠埃希菌BL21/DE3中可被表达,纯化的重组蛋白能被感染华支睾吸虫的大鼠血清识别;CsCALP蛋白主要定位于虫体富含肌肉组织,包括口、腹吸盘、咽部以及皮下肌层;Gel-overlay试验显示CsCALP蛋白能与F-Ac-tin结合。结论构建的pET-28a(+)-CsCALP能在大肠埃希菌中表达可溶性CsCALP蛋白。该蛋白具有良好的抗原活性,主要分布在华支睾吸虫成虫肌肉组织中,可能为分泌排泄抗原的组分之一。