非洲猪瘟病毒MGF-505R基因缺失株双重荧光RPA检测方法的建立及应用

旨在建立一种快速现场筛查非洲猪瘟病毒(ASFV)基因缺失株的方法,以便鉴别我国复杂的ASFV感染情况。通过分析国内ASFV流行态势,选择MGF-505R基因及B646L基因,设计特异性引物及exo探针,对其进行敏感性、特异性分析,并进行临床应用。利用双重-重组酶聚合酶扩增(RPA)方法检测ASFV MGF-505R及B646L基因,结果显示:检测时间在15 min内,最低检测限均为10 copies/反应,且与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型等均无交叉反应;利用所建立方法对266份临床样品进行检测,结果与世界动物卫生组织(WOAH)推荐荧光PCR检测方法的符合率为100%。建立的ASFV MGF-505R基因缺失株的荧光RPA检测方法适配可移动式荧光RPA检测仪,具有快速、灵敏度高、特异性强的优点,适用于ASFV现场快速临床检测,为非洲猪瘟疫情防控提供一种新的筛查手段。

猪制品中非洲猪瘟病毒核酸提取方法的比较

为比较猪制品中非洲猪瘟病毒(ASFV)核酸提取效率,将非洲猪瘟假病毒掺入新鲜猪肉、香肠、血粉试验材料,制备相关模拟感染样品,然后采用核酸免抽提、柱式核酸提取及磁珠吸附核酸提取方法提取ASFV核酸,计算ASFV核酸回收率,评估提取效率。结果显示:猪制品模拟感染样品中,ASFV核酸在上清和沉淀中均被检出,且上清中的检出量高于沉淀;对于香肠模拟感染样品上清,3种核酸提取方法均适合,但以柱式提取方法为佳,病毒回收率高达82.8%;对于新鲜猪肉模拟感染样品上清,以磁珠吸附核酸提取方法为佳,病毒回收率为20.9%;对于血粉模拟感染样品上清,以柱式核酸提取方法为佳,病毒回收率为10.2%。本研究为不同猪制品中ASFV核酸提取提供了参考。

猪瘟病毒装甲RNA颗粒质控品的研制及评估

[目的]研制一种安全稳定高效的猪瘟核酸检测质控品,为猪瘟疫病监测提供技术支持。[方法]将猪瘟病毒核酸检测靶基因构入至新型装甲RNA表达载体pTMACC,转化、表达并纯化,制备猪瘟病毒装甲RNA质控品。借助电泳、电镜、动态散射分析鉴定该物质结构特性,并对其均匀性、稳定性进行分析,评估其实用性能。[结果]该装甲RNA颗粒含有猪瘟病毒特异性基因,序列溯源至法国Thiverval株;为RNA-蛋白复合物,颗粒呈直径约26 nm的多边形;该质控品均匀、稳定,-20℃至少稳定保存36个月;经8家权威实验室性能评估,该物质可以作为猪瘟病毒核酸检测质控品。[结论]猪瘟病毒装甲RNA质控品均匀性良好,稳定性强,无生物传染性,核酸RNA不易降解,可稳定保存,进一步保障猪瘟疫病的临床检测的准确性。

施马伦贝格病毒N蛋白双单抗夹心ELISA检测方法的建立

为建立施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)的双抗体夹心ELISA方法,本研究利用原核表达系统纯化SBV N蛋白,并免疫小鼠制备抗SBV N蛋白单克隆抗体(mAb)。以制备的mAb 4D6作为捕获抗体,HRP标记的mAb 5D3经作为检测抗体,经条件优化,建立了基于SBV N蛋白的双单抗夹心ELISA检测方法。结果显示,捕获抗体和检测抗体的稀释度分别为1∶160000和1∶80000,重组SBV N蛋白浓度在3.9~125 ng/mL范围与OD450nm值呈现良好的线性关系,标准曲线为y=0.0224x+0.3896,R^(2)=0.9715。此方法检测下限为3.9 ng/mL,显示较高的敏感性。该方法检测AKAV、BTV和BVDV均为阴性,具有良好的特异性。因此,本研究建立的双单抗夹心ELISA方法为SBV快速诊断和N蛋白功能研究提供技术支撑。

赤羽病病毒Gc aa465~704的杆状病毒表达和单克隆抗体制备

为制备针对赤羽病病毒(AKAV)糖蛋白Gc的单克隆抗体(mAb),本试验选取AKAV Gc蛋白第465~704位氨基酸的基因序列进行密码子优化并合成至pFastBac HTB载体;通过蓝白斑筛选和昆虫细胞杆状病毒表达系统制备重组AKAV Gc aa465~704蛋白,纯化后免疫小鼠;通过细胞融合和亚克隆筛选阳性杂交瘤细胞,利用Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)对mAb特性进行鉴定。结果显示,本试验成功筛选出1株可稳定分泌抗AKAV Gc aa465~704蛋白mAb的杂交瘤细胞株4D1,Western blot结果显示,mAb 4D1可特异性识别AKAV Gc aa465~704蛋白;IFA结果显示,mAb 4D1能够与AKAV感染的BHK21细胞发生反应。结果表明,本试验成功制备抗AKAV Gc aa465~704蛋白mAb,为进一步研究AKAV Gc蛋白生物学功能和建立AKAV检测方法提供技术支持。

饲料用鱼类、哺乳类及禽类源性成分三重TaqMan-MGB荧光PCR检测方法的建立及应用

为建立饲料用鱼类、哺乳类及禽类源性成分的广谱、快速检测方法,收集Genbank中鳕鱼、鲈鱼、沙丁鱼等鱼类,猪、牛、羊等哺乳类以及鸡、鸭、鹅等禽类的18S rRNA基因序列,分别设计特异性扩增引物和MGB-TaqMan荧光探针,通过优化反应体系和条件,每种引物探针体系均可以特异性检测目标物种类型而与其他物种无交叉反应。3套引物探针体系组合后可同时检测鱼类、哺乳类及禽类源性成分,三重荧光PCR方法的最低检测限可低至0.002 ng或0.02 ng基因组/反应,变异系数均小于2%。利用建立的三重荧光PCR方法检测35份进境及国产饲料样本,从2份进口饲料及1份国产饲料中检出非标定动物源性成分,结果与行业标准方法的检测结果一致,符合率100%。结果表明,本研究建立的三重荧光PCR方法具有特异性、敏感性高、重复性好等优点,为包括饲料在内的动物产制品源性成分定性分析提供了新的技术分析手段。

非洲猪瘟研究新进展

非洲猪瘟是一种严重的"世界经济"动物疫病,也是世界动物卫生组织(OIE)法定报告动物疫病。本文介绍了非洲猪瘟病毒的病原学分类、形态结构及特性,阐述了该病毒可通过直接接触、间接接触和媒介蜱进行传播,分析了非洲猪瘟的实验室诊断和区域化管理方法,并提出了搭建整体性防控体系、加强野生动物研究、加强疫苗研发等建议,以期为我国非洲猪瘟防控提供借鉴。

裂谷热假病毒颗粒研制及鉴定

裂谷热是危害严重的人畜共患病,为了给该病的分子生物学检测提供RNA阳性质控品,制备了裂谷热假病毒颗粒并进行了检测和验证。将pGEM-T-RVF质粒与假病毒载体p-MS2质粒分别进行PstI和HindⅢ双酶切,然后连接构建p-MS2-RVF重组质粒。将p-MS2-RVF重组菌进行表达、酶消化及盐沉淀后纯化假病毒颗粒,在特性检测的基础上,借助荧光RT-PCR方法进行鉴定。结果表明,裂谷热假病毒颗粒耐核酸酶,室温至少保持1个月,稳定,易运输;荧光RT-PCR检测表明最低可达到4.25×102copies检测限。构建的裂谷热假病毒颗粒将为裂谷热分子生物学检测提供阳性质控物质。

假病毒在RNA病毒检测中的应用研究进展

由于核酸检测对于病毒感染的早期诊断和抗病毒治疗疗效的动态观察具有重要价值，近年来，基于RNA的核酸检测技术，如RT—PCR扩增（Mulder，1994）、核酸依赖的序列扩增（NASBA）（Van Gemen，1994）、分枝链DNA（Pachl，1995）、转录调控扩增等技术快速发展起来并广泛应用于RNA病毒的检测。在RNA病毒的定性和定量核酸检测中，实验人员操作中的随机误差、扩增仪孔间温度的差异、标本核酸提取后抑制物的残留、待扩增靶核酸的浓度和逆转录的效率及试剂的问题等，

含组氨酸蛋白标签的蓝舌病假病毒物质构建及定量分析

基于蓝舌病(bluetongue,BT)的危害及RNA阳性质控品研制的重要性,试验将pTrcHis-MS2质粒借助点突变技术在噬菌体外壳蛋白15和16氨基酸之间插入组氨酸(His)蛋白标签,构建了pTrcMS载体。将pMD19-T-BTV质粒与pTrcMS质粒分别进行KpnⅠ和HindⅢ双酶切,然后连接构建pTrcMS-BTV重组质粒。将pTrcMS-BTV重组菌进行原核表达,产物借助偶联His蛋白标签的磁珠捕获技术获得纯化的蓝舌病假病毒颗粒,进行特性鉴定并定量。结果显示,研制的pTrcMSBTV物质经PCR方法评价纯度高,无基因DNA污染;透射电镜观察形态为不规则的直径约为26nm的多边形;RT-PCR方法检测稳定性表明该物质耐RNase A,易保存;应用荧光RT-PCR检测表明该物质溶液最低检测限可达到2.5×102拷贝/mL。蓝舌病假病毒物质将为蓝舌病分子生物学检测提供阳性质控物质。

针药联合治疗原发性干燥综合征口干55例

目的观察针药联合治疗原发性干燥综合征口干症状的改善情况。方法将109例原发性干燥综合征患者随机分为对照组54例和治疗组55例,对照组给予路氏润燥汤加减治疗,治疗组在对照组的基础上加用针刺疗法。2组疗程均为12周,分别于治疗0、1、2、3、4、6、8、10、12周时,观察两组口干视觉模拟评分(Visual Analogue Scale/Score,VAS),于0、4、8、12周时观测两组唾液流率结果,以评价联合针刺疗法对路氏润燥汤的增效作用。结果治疗组与对照组均可改善原发性干燥综合征患者口干VAS及唾液流率水平。在治疗12周时,治疗组口干VAS总有效率为70.91%;对照组口干VAS总有效率为57.41%;差异有统计学意义(P<0.05),2组患者非刺激性唾液流率组间无统计学差异。结论路氏润燥汤联合针刺疗法可更快的改善原发性干燥综合综合征患者口干(VAS)主观症状。

IMS-FMO捕获及富集派琴虫方法的建立

目的派琴虫病是世界范围内的海洋贝类寄生虫病,现有的检测方法或敏感性低,或检测费用高、或操作困难,难以普及推广。本研究将建立一种新的贝类派琴虫免疫磁珠分离纯化检测方法。方法本研究方法包括四部分:(i)捕获;(ii)荧光显微镜观察;(iii)富集;(iv)方法敏感性评价。结果本研究建立的派琴虫免疫磁珠分离纯化方法,检测派琴虫限度可达103个/mL,整个检测过程仅需1个小时,特异性良好。结论派琴虫免疫磁珠分离纯化方法将为水产品中派琴虫的检测提供一种快速简便的技术支持。

南非Ⅱ型口蹄疫间接ELISA检测方法的建立

为满足口岸对南非II型口蹄疫检测、监测的需求，在对南非II型口蹄疫抗原表位分析及相关基因合成的基础上，进行融合蛋白pGEX—VP1-VP3的体外表达，采用柱上酶切方法制备VP1-VP3蛋白。将纯化VP1-VP3抗原包被96微孔板，分别优化抗原包被浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度，确定阴性临界值。经反复优化，建立的南非II型间接ELISA检测方法的最佳抗原包被浓度为6．4ug／ml，血清最佳稀释度为1：200，酶标二抗最佳稀释度为1：4000，阴性临界值（0D450）为0．562。检测样品判定标准为：OD450〉0．622为阳性，OD450〈0．502为阴性，0．502≤OD450≤0．622为可疑。特异性试验结果表明，所建立方法与其它血清型口蹄疫间无交叉反应。南非II型口蹄疫间接ELISA检测方法的建立为我国口岸口蹄疫检疫提供了新的查验方法。

钝缘蜱传播非洲猪瘟病毒的研究进展及防控建议

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fe-ver virus,ASFV)引起的严重危害养猪业的烈性传染病,历史上在非洲、欧洲的多个国家暴发流行。自2007年传入高加索地区以来,疫情在中亚、东欧等地扩散,并于2018年8月在我国辽宁省沈阳地区首次报道,在不到一年的时间里传播到全国31个省.

施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

本研究旨在表达施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)的核衣壳蛋白(N),进而制备其多克隆抗体。以SBV(BH80株)的RNA为模板,RT-PCR扩增N基因序列,并将其克隆至原核表达载体pET-28a-c(+)中,获得pET-28a-SBV-N重组质粒。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达HisSBV-N融合蛋白。在非变性条件下用Ni-NTA柱纯化His-SBV-N,并以此为抗原免疫新西兰大白兔制备多抗。经免疫亲和层析纯化后,利用Western blot和间接免疫荧光对多抗进行鉴定。结果表明:(1)His-SBV-N融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中同时以可溶性和包涵体2种形式表达,相对分子质量约为30ku;(2)制备的多抗效价高达1∶64 000。该多抗不仅能与His-SBV-N融合蛋白发生特异性反应,而且还能识别SBV的不同毒株,但与布尼亚病毒科内亲缘关系最近的沙门达病毒(Shamonda virus)、道格拉斯病毒(Douglas virus)和赤羽病病毒(Akabane virus)的核衣壳蛋白存在交叉反应。His-SBV-N融合蛋白及其多抗的成功制备,为施马伦贝格病血清学检测方法的建立奠定了物质基础。

同时检测贝类派琴虫和包纳米虫的双重LAMP方法的建立

为满足贝类寄生虫快速检测需求,本研究根据GenBank中发布的派琴虫ITS序列和包纳米虫18SrRNA序列的保守区域分别设计LAMP扩增引物,分别建立了两种寄生虫的单重LAMP检测方法,进一步对反应体系进行优化,组装成两种寄生虫的双重LAMP方法,同时还进行了特异性检测和敏感性检测,并通过对扩增产物进行限制性内切酶酶切检验双重LAMP方法的准确性。结果表明本研究建立的贝类寄生虫双重LAMP方法具有较好的特异性,检测派琴虫时的最低检测限为10拷贝/μL质粒DNA,检测包纳米虫时的最低检测限为100拷贝/μL质粒DNA,同时酶切试验也验证了双重LAMP检测结果的准确性。对随机采自东海和黄海的20份菲律宾蛤仔和10份美国进口牡蛎的检测结果显示,该双重LAMP方法在口岸检疫工作中可以作为派琴虫和包纳米虫的快速检测方法。

小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和残缘璃眼蜱的分子生物学鉴定

本研究旨在建立小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和残缘璃眼蜱的分子生物学鉴定方法,并探讨它们的系统发生关系。在新疆、内蒙古从动物体表采集寄生蜱,形态学鉴定后,PCR扩增测序获得3种璃眼蜱的16SrRNA及线粒体色素氧化酶亚基Ⅰ基因(cytochrome oxidaseⅠ,COⅠ)序列后进行同源性分析。用Mega 5.0和Mrbayes 3.2软件分别构建系统进化树,亚洲璃眼蜱、小亚璃眼蜱样本16SrRNA序列与GenBank中已知相应蜱虫16SrRNA序列聚类,而残缘璃眼蜱COⅠ序列与GenBank中已知残缘璃眼蜱COⅠ序列聚类,与形态学鉴定结果一致。在传统形态学分类的基础上,结合分子生物学鉴定方法能简易、准确鉴定小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和残缘璃眼蜱。

亚欧型及南非型口蹄疫一步法多重荧光RT-PCR检测方法建立

【目的】口蹄疫是一种严重的"政治经济病",世界各国面临的口岸疫情防控形势均十分严峻。针对南非型(SATⅠ,SATⅡ,SATⅢ型)潜在入侵中国的严峻态势,为了防止疫情跨境传播,迫切需要建立有效甄别亚欧型(A、O、C及亚洲Ⅰ型)与南非型口蹄疫的检测方法,以进一步提高防控工作的准确性。【方法】选择口蹄疫病毒(FMDV)基因组保守的5'非翻译区(5'UTR)基因为靶序列,分别设计亚欧型及南非型FMDV特异的荧光PCR引物及Taqman探针,通过对反应体系和反应条件的优化,以插入扩增目的片段的阳性克隆质粒为模板,建立多重荧光PCR检测体系;进一步以体外转录cRNA作为阳性质控品,建立亚欧型及南非型FMDV一步法多重荧光RT-PCR鉴别方法,并进行敏感性、特异性确定及田间样本检测。【结果】本研究建立的FMDV多重荧光PCR检测方法,对亚欧型及南非型FMDV阳性质粒的扩增效率均在90%以上;以倍比稀释的体外转录cRNA作为模板,进行敏感性测试表明,本方法最低可检测至7.6×10-9ng南非型cRNA和6.3×10-8ng亚欧型cRNA;特异性试验结果显示本方法可以有效甄别亚欧型与南非型FMDV;田间样本检测结果与样品实际感染情况一致。【结论】本研究建立的FMDV一步法多重荧光RT-PCR检测方法敏感、特异而且快速,为亚欧型与南非型口蹄疫的鉴别诊断及流行病学调查提供了新的方法。

检测施马伦贝格病毒核酸的荧光定量RT-PCR方法

根据施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)S基因节段设计一对引物和TaqMan探针,建立了检测SBV核酸的荧光定量RT-PCR方法。通过优化反应体系和反应条件,该方法对101~107半数组织培养感染量(TCID50)的SBV核酸呈现良好的线性关系。利用德国FLI制备和保存的SBV核酸阳性(n=140)、SBV核酸阴性(n=132)和辛波血清群相关病毒核酸样品(n=16),对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了验证。结果表明,所建立方法与FLI研制的SBV荧光定量RT-PCR具有相近的敏感性,两者对140份SBV核酸阳性样品的检测符合率达96.4%(135/140);可灵敏地检测出1TCID50的SBV RNA,并具有良好的重复性;除道格拉斯病毒(Douglas virus)外,与辛波血清群相关病毒核酸无交叉反应。用该方法对采自内蒙古呼和浩特市某养殖场的绵羊血清(n=47)和澳大利亚进口绵羊血清(n=47)的RNA进行了检测,结果未发现SBV核酸阳性样品。SBV荧光定量RTPCR检测方法的建立为应对施马伦贝格病提供了有效的检测手段。