Epsps基因为筛选标记的多基因抗虫表达载体构建

目的:为了获得水稻的广谱抗虫性,同时也避免由潮霉素抗性基因引起的安全性问题。构建以抗除草剂基因(Epsps基因)为筛选标记的多基因抗虫植物表达载体pCTSK。方法:以双元载体pCAMBIA1300为基础,将潮霉素抗性基因hpt替换成携带烟草叶绿体转运肽序列TSP的草甘膦抗性突变基因aroAM12(编码细菌5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶Epsps)作为筛选标记基因,获得中间表达载体pCTSM1300。然后再连接上3个抗虫基因(马铃薯蛋白酶抑制剂基因Pin-Ⅱ、苏云金杆菌毒蛋白基因Bt cryI(A)及雪花莲外源凝集素基因GNA)的完整表达片段(包含各自的启动子和终止子)。结果:通过PCR方法和酶切方法鉴定已成功地构建了该表达载体;通过不同实验方案的数据分析,得出在载体构建的大分子连接中优化的一次连接法连接效率高于二次连接法的结论。

高效是当前水稻育种的主导目标

社会经济发展和水稻生产比较效益降低,促使水稻育种由过去追求高产为主,转向追求整个过程的高效。全过程高效育种主要体现在三个方面。一是水稻育种技术的高效性。分子标记和基因芯片技术能提高优良基因型的选择效率,基因编辑技术能高效创造优良等位变异,转基因技术能跨物种转移优良性状,都是提高育种效率的好方法。二是水稻产出性状的高效性。高产、卫生和有益健康是获得高收益的基础,优质是提高单位产量效益的乘数,多抗是减少单位产量成本的除数,早熟能保证一年两收,这些性状的整体协同才能实现单位面积稻田产出的高效益。三是水稻耕作性状的高效性。一年两熟制下的水稻直播栽培是高效的耕作技术,它需要水稻具备苗期耐低温、穗期耐低温、厌氧发芽、耐淹涝等特征。化学除草需要水稻具有抗除草剂特征。机械化收割要求水稻具有抗倒、不易落粒的特征。只有具备这些特征的水稻,才能实现水稻耕作过程的高效。总之,高效是当前和今后水稻育种的主导目标。

OsbHLH1基因过表达载体构建及转化水稻研究

OsbHLH1基因编码bHLH类转录因子,与水稻耐寒性相关。以pCAMBIA3300为母体,利用玉米泛素(Ubiquitin)启动子构建了能使OsbHLH1基因过表达且含有Bar基因的植物表达载体p3300-Ubi-Ω-OsbHLH1。利用基因枪法将其转化到粳稻品种东稻3号中,获得再生苗47株。选取其中9株进行PCR、Southern检测,结果表明目的基因已经整合到水稻基因组中;草铵膦叶片涂布试验结果表明,Bar基因在水稻植株中正常表达;低温处理后,除45号植株外,其余8株光合速率的变化率显著低于非转基因对照,初步证明OsbHLH1基因在水稻中过表达显著提高了水稻的耐低温能力。

转山菠菜胆碱单加氧酶基因(AhCMO)水稻创制及其耐盐性研究

胆碱单加氧酶(Choline monooxygenase,CMO)是高等植物体内合成甜菜碱的一个关键酶.利用载体pCAMBIA3300与玉米泛素(Ubiquitin)启动子构建了AhCMO基因的过表达载体.采用基因枪轰击愈伤组织细胞将AhCMO基因转化东稻3号(OryzasativaL.subsp.japonica Kato),经抗性筛选,获得再生苗18株,选取农艺性状与野生型基本一致的其中7株进行PCR与Southern杂交检测,获得3株转AhCMO基因阳性植株;RT-PCR的检测结果表明外源AhCMO基因能正常转录;草铵膦叶片涂布试验结果表明,Bar基因在转AhCMO基因水稻植株中能正常表达;对T1代转基因再生植株进行0.5%NaCl高盐处理,结果表明,4号、7号转AhCMO基因水稻耐盐性强于非转基因对照,说明外源AhCMO基因能提高东稻3号的耐盐性.

水稻OsNRAMP5基因低镉积累突变位点功能标记的开发与验证

为了对水稻低镉积累基因进行精准检测和世代跟踪,提高低镉积累水稻品种的分子标记辅助育种(MAS)选育效率,基于籼稻品种9311及其低镉积累突变体lcd1材料7号染色体上OsNRAMP5基因第7外显子单核苷酸的突变,参照四引物扩增受阻突变PCR(Tetra-primer amplification refractory mutation system-PCR,Tetra-primer ARMS-PCR)原理设计了共显性功能标记nra5fun,且采用PCR方法分别对18份籼稻、18份粳稻及金23B/lcd1杂交F_(1)代材料进行分子标记特异性验证。电泳结果表明,含OsNRAMP5基因SNP突变材料lcd1可扩增出大小为723 bp、210 bp的条带,含野生型OsNRAMP5基因的材料9311可扩增出大小为723 bp、557 bp的条带,金23B/lcd1 F_(1)代杂合型材料可扩增出大小为723 bp、557 bp、210 bp的条带,共显性标记nra5fun得到的电泳条带与引物设计时预测的目标片段完全吻合;Sanger测序结果表明,电泳扩增条带片段的序列与目的基因的DNA序列和SNP突变位点的序列一致;18份籼稻和18份粳稻种质资源均能扩出大小为723 bp、557 bp 2个目的条带,说明这些材料均不含有OsNRAMP5基因的单个SNP突变,表明该标记特异性较高。因此,开发的功能标记nra5fun能够准确、高效地识别水稻低镉积累基因的纯合突变型、纯合野生型和杂合型,可在水稻低镉积累分子育种中推广应用。

不同遗传背景籼稻白叶枯病抗性基因Xa21、Xa23品系的抗性评价

以含有水稻白叶枯病抗性基因Xa21和Xa23的材料为供体,以课题组选育不含Xa21或Xa23基因的材料为受体,通过杂交、复交等方法,并采用分子标记辅助选择(molecular marker-assisted selection,MAS)世代选择,将含有Xa21和Xa23基因的材料、含与不含Xa21或Xa23基因的姊妹系接种7种广泛使用的白叶枯病菌种生理小种,分析了这些材料白叶枯病的抗性。研究表明含有抗性基因Xa21的水稻材料抗性累计(HR、R、MR)所占比例依次为菌株HNA1-4、PXO86(84.62%)>YN24(82.14%)>GD1358(73.08)>PXO99(67.86%)>GDA2(63.33%)>FuJ(6.67%),表明含Xa21基因材料对菌株FuJ所诱发的白叶枯病基本无抗病能力,但对于其他菌株,仍有36.67%~15.38%的材料易感病;含Xa23基因的材料在所有诱发菌株中抗性累计(HR、R、MR)均在76%以上,仍有23.02%~15.52%的材料对7种诱发菌株没有抗性。通过对菌斑长度变异系数大小的分析,表明含有Xa21或Xa23基因的材料对不同菌株抗病能力或对同一菌株的抗病能力不同材料有较大的变化。通过对诱发白叶枯病菌株间菌斑长度的相关性分析,表明含有Xa21的材料菌株GDA2或HNA1-4与对应的其他6菌株之间达到了显著或极显著正相关,含有Xa23基因的材料菌株YN24、GD1358、PXO86与对应的其他6种菌株间呈极显著正相关,含此2类基因材料抗性鉴定选取对应菌系可以提高选育效率。通过对姊妹系的分析表明,Xa21或Xa23基因的白叶枯病抗性与选育材料的背景有关。相关性分析表明,Xa21基因的材料抗性与亲本材料呈极显著正相关(R=0.5725^(**)),Xa23基因材料抗性与亲本材料呈显著正相关(R=0.2212^(*))。

不同氮素水平下恢复系及杂交稻组合氮肥高效利用

为了比较利用MAS选育的氮高效型恢复系及其杂交稻组合在不同氮素水平下的农艺性状差异。本研究以抗病虫害和氮高效的多基因聚合恢复系R4302、R4312及其配制的8个杂交稻组合为试验材料,‘华占’‘天优华占’为对照,设置0 kg/hm~2(N)、112.5 kg/hm~2(N)、150 kg/hm~2(N)、187.5 kg/hm~2(N)4个氮肥水平,成熟期测定与分析供试材料的单株有效穗数、单株产量、干物质产量、氮肥农学利用率、氮肥偏生产力和收获指数。结果表明,不同氮素水平下R4302各农艺性状均优于‘华占’,R4312除氮肥农学利用率外其他农艺性状优于或接近‘华占’,表明OsTCP19基因的丢失并未影响R4302、R4312氮肥的高效利用;杂交稻组合天丰A/R4302、天丰A/R4312为氮高效型组合;贵A/R4302、科20A/R4312、香龙A/R4302、科4364A/R4312为低氮高效型组合;荃9311A/R4302属于双高效型组合;科20A/R4302属于高氮高效型组合;恢复系可用单株产量、氮肥农学利用效率、干物质产量其中1项指标或有效穗数来评估氮肥的利用效率;杂交稻组合可用单株产量、干物质产量、氮肥偏生产力、氮肥农学利用率、有效穗数、收获指数其中1项指标来评估氮肥的利用效率。本研究为通过氮高效基因选育氮肥高效利用型恢复系和杂交水稻组合提供参考。

不同遗传背景籼稻Xa23基因品系的白叶枯病抗性筛选和评价

【目的】系统比较分析含Xa23基因的籼稻品系白叶枯病抗性,为白叶枯病抗性育种及水稻白叶枯病防治等提供种子资源,同时为白叶枯病分子抗性育种提供参考。【方法】以14种遗传背景不同且含有Xa23基因的81份籼稻品系为材料,孕穗期采用剪叶接种法接种7种南方稻区白叶枯病生理小种代表菌株(FuJ、YN24、HNA1-4、GDA2、PXO86、GD1358和PXO99),接种20 d左右当参试材料的病情趋于稳定时,量取病斑长度,鉴定参试材料的抗病性。【结果】供试材料对7株白叶枯病菌菌株的抗感分析结果显示,81份品系中有74份品系对7株白叶枯病菌菌株均为抗病,其中35份品系对所有菌株为高抗;含Xa23基因品系对7株白叶枯病菌菌株的抗性频率大小为:PXO86和YN24(100.0%)>GD1358和HNA1-4(98.8%)>PXO99(96.3%)>GDA2(95.1%)>FuJ(93.8%);同一遗传背景品系对7株白叶枯病菌菌株病斑长度的变异系数在100.0%以上的有遗传背景为A、B、C、E、F和H类品系对菌株FuJ,遗传背景为A、B、D和E类品系对菌株GDA2,遗传背景为A类品系对菌株GD1358和HNA1-4,遗传背景为A和B类品系对菌株PXO86、PXO99,遗传背景为A、C和E类品系对菌株YN24;对14种遗传背景不同品系白叶枯病抗性的方差分析结果表明,不同来源含Xa23基因的品系与7株白叶枯病菌菌株间病斑长度均无显著差异(P>0.05);对含Xa23基因的品系在7株白叶枯病菌菌株诱发下的菌斑长度的相关性分析结果表明,菌株GD1358、HNA1-4、PXO86和YN24与对应的其他菌株间呈显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)正相关。【结论】在白叶枯病抗性研究时选用菌株GD1358、HNA1-4、PXO86和YN24其中1种抗源接种试验材料,即可得到较宽抗谱的抗性材料,提高育种效率。

抗除草剂转基因稻米蛋白的消化稳定性和热稳定性分析

为抗除草剂转基因水稻食用安全性评价中的致敏性评估提供参考,对抗除草剂转基因稻米蛋白的消化稳定性和热穗定性进行分析.体外模拟胃肠液消化和热加工处理抗除草剂转基因水稻Bar68-1稻米蛋白、非转基因亲本对照D68稻米蛋白、阴性对照酪蛋白、阳性对照大豆胰蛋白酶抑制剂和牛血清蛋白,通过SDS-PAGE凝胶电泳观察它们在各时间点的降解情况.研究结果显示：消化稳定性试验中,转基因稻米蛋白和非转基因稻米蛋白在2 ～30 min内全部消化,可判断它们在模拟胃、肠液中可消化;热稳定性试验中,转基因稻米蛋白和非转基因稻米蛋白一样,在一定温度下（60、75、90、100℃）加热一定时间（15、30、60、120 min）后仍具有较好的热稳定性.结果表明,转基因抗除草剂水稻Ba68-1具有较好的热稳定性,在模拟胃液和模拟肠液中均可消化,不具备过敏原抗消化性的特征.

转基因抗除草剂水稻Bar68-1的遗传稳定性分析

目的基因的稳定遗传和稳定表达是转基因水稻的必备特性,也是转基因水稻安全评价的重要科目。采用PCR、Southern杂交、RT-PCR、ELISA和除草剂抗性鉴定技术,对转基因抗除草剂水稻Bar68-1进行遗传稳定性分析。研究结果表明,Bar基因已整合在转基因抗除草剂水稻Bar68-1基因组中并可稳定遗传,在转录水平和翻译水平上均可检测到目的基因的稳定表达,在表型上检测出Bar68-1对草铵膦除草剂具有抗性。

秋茄叶绿体基因组密码子使用偏好性分析

为了确定秋茄叶绿体基因组密码子的使用模式及其成因,以筛选到的50条蛋白质编码序列为研究对象,利用CodonW 1.4.2和CUSP在线程序对其密码子使用偏好性进行分析。结果表明:秋茄叶绿体基因组密码子第3位的GC含量(GC 3)较低,平均值为27.62%,有30个密码子的相对同义密码子使用度(U RSC)>1,其中以A/U结尾的密码子29个,说明秋茄叶绿体基因组偏向使用以A/U结尾的密码子;有效密码子数(N ec)的平均值为47.02,密码子使用偏好性较弱;N ec和GC 3之间呈显著正相关(r=0.329,P<0.05),表明密码子第3位上的碱基组成影响密码子使用偏好性。中性分析结果显示,GC 3和GC 12相关性显著(r=0.464,P<0.01),回归系数为0.7064,说明突变对密码子使用偏好性有重要影响。N ec-plot分析和奇偶偏好性分析表明,自然选择也是重要的影响因素。基于rbcL基因序列的系统进化树和基于U RSC值的聚类分析有一定的相似性,表明密码子使用偏好性与物种之间的亲缘关系有关。综合分析表明,突变是秋茄叶绿体基因组密码子使用偏好性的重要因素,同时自然选择和碱基组成也有一定影响。ACC、ACA和GCA为最优密码子。

含草甘膦抗性标记的水稻核不育繁殖系载体构建与验证

【目的】使用草甘膦抗性基因替代潮霉素抗性基因,构建核不育繁殖系的转化载体,赋予繁殖系对除草剂草甘膦的抗性,规避现行政策对转基因作物中使用抗生素标记基因的限制。【方法】利用同源重组的方法,构建含草甘膦抗性基因Epsps#、花粉致死基因ZmAA1、核不育恢复基因OsEat1和红色荧光基因DsRed2的水稻eat1核不育基因繁殖系载体pC3300-Epsps-AA-Eat-Red;采用农杆菌介导法转化水稻。【结果】通过转化籼稻品系9K19-5获得普通核不育繁殖系Eat9K的转化植株318个。表型鉴定表明,单拷贝转化体Eat9K-3的花粉有可育和不育2种类型,种子有具有和不具有荧光信号2种类型,具有荧光信号的种子在发芽期能耐受浓度至少为1 g/L的草甘膦。建立的四引物检测法能够区分野生型Eat1基因和核不育eat1基因。【结论】证明载体pC3300-Epsps-AA-Eat-Red有效,创制了具有除草剂抗性的普通核不育繁殖系新种质,建立了区分野生型Eat1基因和核不育eat1基因的四引物检测法。

粮饲兼用型玉米新品种科玉1108适宜密度研究

以科玉1108为材料,设4个种植密度处理(4.5、5.25、6.0、6.75万株/hm^2),研究密度对粮饲兼用玉米籽粒产量和青贮生物产量的影响。结果表明:随着密度的增加,株高和穗位高增加,行粒数、千粒重、单株生物鲜重和单穗重降低,籽粒产量和青贮生物产量呈抛物线分布。收获籽粒的最佳种植密度为5.25万株/hm^2,做青贮玉米的适宜种植密度在6.0万~6.75万株/hm^2,两者兼顾的合理种植密度为5.25万~6.0万株/hm^2。

不同植物FERONIA基因密码子使用偏好性分析

为了了解植物FERONIA(FER)基因在长期进化过程中所形成的密码子使用模式及它们之间的亲缘关系,采用Codon W、CUSP在线程序和SPSS等分析软件对不同植物的FER基因密码子进行碱基组成分析、对应性分析、PR2-Plot分析、中性绘图分析和ENC-Plot分析并进行聚类分析。结果表明,单子叶植物FER基因密码子的平均G+C含量高于双子叶植物,且单子叶植物偏好使用以G/C结尾的密码子,而双子叶植物偏好使用以A/T结尾的密码子。对应性分析结果显示,在单子叶植物、双子叶植物中,向量轴1(Axis 1)可解释的变异分别占总变异的42.25%、28.56%。在单子叶植物中,Axis 1与总G+C含量、GC3含量、G3含量、C3含量呈极显著正相关(P<0.01),而在双子叶植物中则呈极显著负相关(P<0.01)。不同的碱基组成是单子叶植物和双子叶植物形成密码子使用偏好性的重要原因。PR2-Plot分析结果、中性绘图结果和ENC-Plot分析结果表明,自然选择是形成植物FER基因密码子使用偏好性的主要驱动力。基于编码序列(Coding sequence,CDS)构建的系统进化树比基于同义密码子相对使用度(RSCU)得出的聚类分析结果更接近传统的分类结果。本研究结果可为进一步开展植物分子进化和基因工程研究奠定基础。

外差探测随机相位调制连续波激光测距的快速解调方法

基于外差相干检测的随机相位调制连续波激光测距具有灵敏度高、对背景噪声容忍度高等优点,但传统的解调方法都是基于序列移位相乘和傅里叶变换,需要消耗大量计算资源和计算时间。提出并验证了一种针对随机相位调制连续波激光测距的快速解调方法,通过对回波外差信号进行傅里叶变换得到多普勒频移,解调出目标速度信息,然后通过数字下变频获得回波信号的正交分量,最后利用傅里叶变换在频域实现伪随机调制序列与回波信号的循环卷积,得到目标的位置信息。在原理验证实验中,使用长度为2 047的11阶伪随机二进制序列,调制速率为40 MHz,利用快速解调方法从回波信号中成功恢复了目标位置和速度,并在光纤中实现了2.7 m的距离分辨率。

高转换效率单谐振连续波近红外光学参量振荡器

提出了一种高功率及高转换效率的可调谐连续波近红外外腔单谐振光学参量振荡器。为了获得短波段近红外可调谐激光光源,基于准相位匹配晶体的光学参量振荡技术是其中一项有效的技术手段。光学参量振荡器采用连续波532 nm激光器作为泵浦源,掺杂氧化镁的周期性极化化学计量比钽酸锂(MgO:sPPLT)晶体作为准相位匹配晶体,通过在周期调谐的基础上再结合温度调谐的组合调谐方式,在8.3~8.6μm的4个极化周期内实现了信号光807~879nm和闲频光1352~1567nm近红外宽波段的无跳模可调谐激光输出。通过闲频光单谐振设计,当泵浦功率5.4 W时,在8.6μm周期处,获得了3.1 W的821 nm的近红外信号光输出,实现了57.4%的信号光光-光转换效率。当泵浦功率达到13.6 W时,在8.6μm周期处,获得了6.8 W的高功率输出。

窑尾废气管喷水降温系统的问题和改进

我公司5000t／d生产线在预热器的窑尾废气管道上布置了一套喷水系统，用于取代增湿塔对窑尾废气进行增湿降温。本文对在使用该喷水系统中遇到的一些问题和改进措施作一总结。

TRM53.41生料立式磨提产降耗的优化措施

本公司5000t／d生产线的生料磨采用了TRMR53．41立式磨，设计台时产量〉420t／h。该立磨系统自2011年底试机投产以来，设备运行基本正常，磨机工况也基本稳定，但各项产质量运行指标与国内同类型磨机的先进水平相比仍然差距较大。为此，公司在2012年5月专门组织了立磨系统的提产降耗攻关小组，通过采取一系列的优化措施，取得了良好的效果，具体情况介绍如下。

油坑建材5000t/d生产线窑系统调试总结

1 基本概况 我公司5000t／d熟料生产线采用了双系列五级高效低压损旋风预热器＋第三代11TF型分解炉系统；其回转窑规格为中4．8m×72m，斜度3．5％，转速0．4～4．5r／min，电机功率710kW；另采用了TC-12108篦冷机（有效面积：128．6m2）和TCNB—S型双旋流燃烧器。

两类水稻Nramp5基因突变体衍生系在镉污染稻田中糙米镉锰积累特征分析

以来源于珞红4A的Nramp5基因缺失突变型、来源于lcd1的Nramp5基因点突变型及缺失与点突变的杂合体为材料,比较在有效镉(Cd)含量为0.58 mg/kg(pH值5.3)的中度污染稻田种植条件下不同突变类型和遗传背景材料的糙米Cd和锰(Mn)含量。结果表明,遗传背景不影响由Nramp5基因缺失或点突变所赋予的糙米Cd和Mn低积累特性;Nramp5基因缺失突变与点突变的杂合体的糙米Cd含量为0.082mg/kg,显著低于含野生型Nramp5基因的对照品种9311(2.345 mg/kg),且与Nramp5基因缺失或点突变的纯合体相比,Cd含量和Mn含量均无显著差异;Nramp5基因缺失纯合体、点突变纯合体及缺失与点突变杂合体的糙米Cd含量均符合国家食品安全标准(≤0.2 mg/kg)。因此,来源于珞红4A的Nramp5基因缺失突变的亲本与来源于lcd1的Nramp5基因点突变的亲本配组,其杂交种仍然具有糙米Cd低积累特征,本研究为杂交水稻低镉积累分子育种提供了重要参考数据。