促细胞增殖新基因TOX的功能研究

利用GenBank中的数据,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)从人的cDNA文库中克隆得到功能基因TOX(thymocyte selection-associated high mobility group box),运用生物信息学分析其结构特性,并通过逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)分析TOX在细胞系中的表达;利用荧光显微镜观察其亚细胞定位情况;使用细胞生长曲线实验和流式细胞术分析TOX对细胞增殖及细胞周期的影响.结果表明:TOX基因定位于人8号染色体q12.1上,全长4 131bp,编码526个氨基酸,该蛋白质分子质量约为57ku,含有9个外显子和8个内含子,其编码蛋白为高迁移率蛋白家族成员,能参与基因调控等生理过程;TOX基因在白血病细胞系Jurkat和Raji中高表达,并定位于细胞核中;对细胞生长曲线绘制及细胞周期分析表明,TOX能够使细胞生长速度加快,且S期细胞比例明显上升.说明TOX参与了细胞增殖调控,有可能研究开发为药物靶标或疾病标志物.

几种免疫增强剂对中华鳖红细胞数量及免疫功能的影响

在基础饲料中添加2.0μg/g亚硒酸钠、0.5μg/g硒酵母、0.3%β-葡聚糖和0.25%果糖,投喂100 d后,测定中华鳖红细胞数量和四个免疫指标的变化。主要结果为:(1)在红细胞数量方面,亚硒酸钠组、果糖组、硒酵母组显著高于β-葡聚糖组及对照组(P<0.05);(2)在红细胞C3b受体花环率和T淋巴细胞活性E花环率方面,四个试验组显著高于对照组(P<0.05);(3)在红细胞天然免疫粘附肿瘤细胞花环率上,仅亚硒酸钠组显著高于对照组(P<0.05);(4)在白细胞吞噬活性上,亚硒酸钠组显著高于β-葡聚糖及对照组(P<0.05),硒酵母组、果糖组显著高于对照组(P<0.05),但β-葡聚糖组与对照组间差异不显著(P>0.05);(5)红细胞C3b花环率与T淋巴细胞活性E花环率间存在明显的正相关(P<0.01),表明中华鳖红细胞具有免疫调节作用。以上结果表明,在饲料中添加不同的免疫增强剂,能提高中华鳖血液中红细胞含量,增进免疫功能,从而提高对疾病的抵抗力。

一个抑制AP-1活性的人类新基因AC3-33的克隆和初步功能研究

Activator protein-1(AP-1)是重要的转录因子,其活性失调与肿瘤等多种疾病直接相关。本文运用"高通量高内涵细胞筛选技术(high throughput-high content cell-based screening technology)"对650个以未知功能基因为主的人类基因进行AP-1双荧光素酶报告基因筛选(Dual-Luciferase reporter gene screening),获得了一个可抑制佛波酯(PMA)加离子霉素(Inonmycin)诱导的AP-1活性的人类新基因AC3-33(GenBank中该基因名为C3orf33,No.FLJ31139)。生物信息学分析该基因序列全长1931bp,由6个外显子和5个内含子组成,定位于3q25.31,从271～1026有一个编码251个氨基酸的可读框,编码一个约29kDa的蛋白,在肾上腺和宫颈等多种组织都有表达。AC3-33与其他人类已知蛋白质没有明显的同源性,亚细胞定位于细胞质中,许多氨基酸序列高度保守。初步实验结果显示AC3-33是一个有重要功能的人类新基因。

分泌型CTLA-4融合恶性疟原虫核酸疫苗联合GM-CSF增强小鼠免疫反应

目的研究分泌型细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)融合恶性疟原虫核酸疫苗联合粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)免疫对小鼠体液免疫和细胞免疫反应的影响。方法将疟原虫抗原编码序列与小鼠CTLA-4胞外区序列拼接构建真核表达载体VR1012-s ES312-CTLA,用Western blot检测转染HEK293细胞上清液蛋白表达。VR1012-s ES312-CTLA和小鼠GM-CSF的真核表达载体共同电穿孔法免疫Balb/c小鼠,ELISA检测疟疾疫苗特异性抗体Ig G效价以及ELISPOT方法分析细胞因子IFN-γ和IL-4的表达水平。结果疟疾DNA疫苗体系中引入CTLA-4分子以及GM-CSF佐剂能显著增强疫苗的特异性免疫反应。VR1012-s ES312-CTLA+GM-CSF联合免疫小鼠,抗体滴度比单纯的疟疾DNA疫苗VR1012-ES312相比提高190倍(P<0.001)。结论将疟疾DNA疫苗改造为树突细胞靶向型,并在免疫体系中引入GM-CSF分子佐剂,显著增强了小鼠体液和细胞免疫效力。此结果为有效提高疟疾DNA疫苗免疫应答水平提供了新的思路。

活体电穿孔导入法增强恶性疟原虫核酸疫苗免疫反应研究

目的采用活体电穿孔免疫方法,研究恶性疟原虫DNA核酸疫苗不同免疫剂量对于动物免疫反应的影响,并对载体中Cp G寡脱氧核苷酸基序的免疫刺激活性进行了初步探讨。方法将恶性疟原虫多表位嵌合抗原M.RCAg-1基因克隆于真核表达载体VR1012中,使用电穿孔导入方法免疫小鼠,采用ELISA检测抗体效价、ELISPOT测定细胞因子分泌水平,探索基因疫苗最佳免疫剂量以及考察免疫反应类型。使用计算机分析恶性疟核酸疫苗中特殊CpG基序组成,实验验证基因疫苗中CpG基序的免疫刺激活性。结果相同DNA免疫剂量下,电穿孔免疫法与单纯肌内注射免疫法相比较,小鼠血清IgG抗体效价提高118倍,且能显著诱导体内特异性Th1和Th2型细胞反应。电穿孔免疫小鼠血清可识别天然虫体抗原,抗体效价可达1∶1200。恶性疟原虫核酸疫苗抗原DNA含有24个CpG免疫活性基序,可以有效的刺激人外周血单个核细胞(PBMCs)增殖与IL-6分泌。结论活体电穿孔方法可以显著提高恶性疟原虫DNA疫苗体液免疫和细胞免疫水平。

原核表达及一步法制备可溶性白喉毒素突变体CRM197

目的构建一种新型的重组蛋白大肠杆菌胞内自动切割表达系统表达可溶性的CRM197重组蛋白,实现一步法纯化。方法将CRM197编码序列与硫氧还蛋白(Trx)序列融合并克隆于原核表达载体p ET-32a(+)载体上,Trx与CRM197之间加入HRV3C(人鼻病毒3C)蛋白酶识别区序列和组氨酸纯化标签编码序列,HRV3C蛋白酶基因克隆于原核表达质粒p GArasd,共同转化大肠杆菌Origami B(DE3),15℃温和诱导,并使用Ni-NTA基质亲和纯化CRM197重组蛋白。结果 CRM197融合蛋白表达后,随即被伴随表达的HRV3C蛋白酶水解释放出游离的带His标签的CRM197重组蛋白,经过一步法亲和纯化,得到纯度约95%的CRM197样品。与DNA共同孵育,显示所获CRM197重组蛋白具有脱氧核糖核酸酶活性。结论通过构建新型的双质粒自动切割原核表达系统,简化了在大肠杆菌表达纯化可溶性CRM197重组蛋白的工艺,降低了制备成本。

细胞水平筛选鉴定激活核因子κB通路的新基因TMEM9B

核因子κB(NF-κB)是细胞内重要的转录因子,其介导的细胞信号转导通路在细胞凋亡中的作用是国内外研究的热点.为了筛选NF-κB通路相关新基因,建立了基于细胞水平的报告基因高通量筛选模型.利用双荧光素酶报告系统检测报告基因荧光素酶活性,通过对构建的439个人类未知功能基因的筛选,获得了一批激活NF-κB信号通路的功能基因,其中基因TMEM9B可以明显激活NF-κB通路.进一步实验显示TMEM9B激活NF-κB通路呈明显剂量依赖性,Westernblot及EMSA实验证实,TMEM9B能够促进胞质内NF-κB的抑制分子IκBα的降解,并促使NF-κB由胞质向胞核转移,同时流式细胞术实验发现TMEM9B可引起293T和HeLa细胞的凋亡.总之,所建立的基于细胞水平的NF-κB通路筛选模型稳定高效,筛选并验证TMEM9B可明显激活NF-κB信号转导通路,并从而引起细胞凋亡.

PIK3IP1与其新剪切体PIK3IP1-v1均定位于细胞膜并诱导细胞凋亡

目的:发现和克隆人类基因PIK3IP1的新变异体并鉴定其功能,研究其对细胞活力的影响和亚细胞定位,分析PIK3IP1在细胞系中的表达情况。方法:利用GenBank中的数据,从人的混合组织cDNA中通过PCR克隆PIK3IP1和它的新剪切体PIK3IP1-v1,运用生物信息学分析其结构特性。经萤光素酶活性检测、细胞形态观察和流式细胞检测研究PIK3IP1和PIK3IP1-v1对细胞存活力的影响,使用荧光显微镜观察其亚细胞定位。最后通过RT-PCR分析PIK3IP1在细胞系中的表达情况。结果:获得PIK3IP1和新剪切体PIK3IP1-v1的真核表达质粒和融合绿色荧光蛋白表达质粒。生物信息学分析显示,PIK3IP1和PIK3IP1-v1均有信号肽并包含跨膜结构域,但后者胞外缺失一个Kringle结构域。功能分析发现,PIK3IP1和PIK3IP1-v1均可诱导细胞凋亡。荧光显微观察证实,PIK3IP1的两种剪切体均定位于细胞膜。RT-PCR证明PIK3IP1在多种细胞中转录水平较低。结论:新剪切体PIK3IP1-v1和PIK3IP1均定位于细胞膜并诱导细胞凋亡,而且在多种细胞中低水平转录。

恶性疟疾疫苗M.RCAg-1与候选佐剂纳米乳配伍的免疫原性研究

为了评价纳米乳作为佐剂对恶性疟疾人工重组蛋白疫苗M.RCAg-1免疫原性的影响,将纳米乳佐剂与M.RCAg-1相配伍,于第0、14、28 d肌肉注射免疫小鼠,抗原量为20μg/只。第3次免疫后10 d,眼球取血并取脾细胞。采用ELISA法检测小鼠血清特异性Ig G抗体水平、抗体亚类及其对抗原单表位的识别,用间接免疫荧光反应(IFA)检测抗体对恶性疟原虫天然蛋白的识别,用ELISPOT法检测小鼠脾淋巴细胞免疫应答水平。结果显示疫苗佐剂组小鼠血清中抗M.RCAg-1的抗体水平可达1∶108;疫苗佐剂组产生的特异性Ig G抗体以Ig G1为主;疫苗佐剂组抗体对抗原单表位和天然虫体的识别效果显著。各表位和蛋白诱发免疫小鼠分泌IFN-γ的特异性淋巴细胞克隆数高于分泌IL-4的特异性淋巴细胞克隆数。结果提示纳米乳作为恶性疟疾疫苗M.RCAg-1的佐剂,能够显著提高机体的体液免疫和细胞免疫应答水平。

利用线粒体膜电位测定筛选参与细胞凋亡的人类新基因

细胞凋亡(apoptosis)属于细胞程序化死亡(programmed cell death),是细胞内涉及到许多生化反应的复杂过程.建立了基于细胞水平的凋亡筛选模型,用于筛选人类基因组中功能未知的序列,以发现与细胞凋亡相关的新基因.通过构建人类未知基因的表达文库,并将未知基因表达载体瞬时转染HeLa细胞,用阳离子染料JC-1标记HeLa细胞线粒体内膜并检测线粒体跨膜电位,用流式细胞术进行阳性结果的验证.经过对未知基因表达文库内600个新基因的筛选,得到7个线粒体跨膜电位下降相关新基因(CHMP6、CGI-38、hCAP-H2、NUDT16L1、ARMC1、PHF17和FLJ21103),经实验验证,其中3个基因(CHMP6、CGI-38和hCAP-H2)与细胞凋亡相关.结果表明,所建立的基于细胞的凋亡筛选模型稳定高效,3个细胞凋亡相关基因将被进行深入研究.

C17orf62诱导细胞死亡的作用及其机制

目的:克隆功能未知的人类新基因C17orf62的长编码序列(C17orf62-L),分析其在细胞系中的表达情况,研究其在细胞内定位情况及其对细胞活力的影响。方法:利用GenBank中的数据,通过聚合酶链反应(polymerasechain reaction,PCR)从人的cDNA文库中克隆C17orf62编码187个氨基酸的长编码序列C17orf62-L,运用生物信息学分析其结构特性。通过逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)分析C17orf62在细胞系中的表达情况。经激光共聚焦显微镜观察C17orf62-L的亚细胞定位情况。使用流式细胞检测以及Western blot实验,分析C17orf62-L对细胞活力的影响及其机制。结果:生物信息学分析显示,C17orf62-L具有信号肽切割位点并包含跨膜结构域。RT-PCR证明C17orf62-L在多种细胞系广泛表达;激光共聚焦实验证实,C17orf62-L广泛分布于胞质,并且与高尔基体部分共定位。功能分析发现,C17orf62-L可诱导细胞死亡,且可通过多聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)切割发挥作用。结论:C17orf62是一个新的人类细胞死亡诱导基因。

人源miR-185通过靶向恶性疟原虫var基因减弱感染红细胞粘附作用的研究

为了探讨人源miR-185对恶性疟原虫vor（pfl1955w）基因表达调控并观察感染红细胞粘附所受到的影响，体外培养293T细胞和恶性疟原虫3D7，构建双荧光素酶报告质粒和表达质粒，再分别利用Lipofectamine2000转染293T细胞和Cytomix电转恶性疟原虫3D7，流式细胞仪检测转染效率，用双荧光素酶报告验证人源miR-185对var（pfll955w）的dbl区域直接调控作用，Q-PCR检测vat（胡1955w）mRNA的表达，细胞粘附实验检测感染红细胞的粘附。结果显示，293T细胞和3D7的转染效率在50％以上，过表达人源miR-185可显著抑制含vat（pfll955w）dbl的荧光素酶基因的表达；在293T细胞和3D7中，人源miR-185能够减少var（pfl1955w）mRNA的含量，并使感染红细胞粘附作用下降了39％。结果表明，人源miR-185对疟原虫var（pfll955w）基因表达有下调作用，进而影响恶性疟原虫的粘附。

爱是教育永恒的主题

没有爱就没有教育,爱是教育永恒的主题,这是不少教育家对教育实践经验的高度概括。师爱是师德的灵魂。教师必须热爱自己的事业和热爱自己的学生,托尔斯泰就曾经这样说:"教师既热爱事业,又热爱学生,他就是一个十全十美的教师。"

提高艺术类大学英语课堂教学效果的策略研究

随着高校大学英语教学改革的进一步深入,当前艺术类大学英语教学存在的不足亦成了艺术类大学英语教学亟待解决的问题.为了更好地提高艺术类大学英语课堂教学效果,老师们理应给予班级及与自身教学相关的问题应有的重视.本文从当前艺术类英语课堂教学现状出发,对其存在的不足进行了详细的阐述,并提出了诸多创新性对策,以更好地促进艺术类大学英语课堂教学效果的提升.

阿仑膦酸钠作为口服佐剂对恶性疟原虫多表位嵌合抗原M.RCAg-1免疫原性的影响

目的评价口服阿仑膦酸钠(alendronate,ALD)对恶性疟原虫多表位嵌合抗原M.RCAg-1免疫原性的影响。方法分别用不同剂量的ALD(0.05、0.1、1 mg)和M.RCAg-1配伍后免疫BALB/c小鼠,M.RCAg-1蛋白经背部皮下注射免疫,20μg/只,同时经灌胃给药ALD,共免疫3次,每次间隔14 d,于末次免疫后10 d经小鼠尾静脉采血,分离血清。ELISA法测定小鼠血清中抗M.RCAg-1蛋白的抗体滴度、IgG抗体分型及血清抗体对M.RCAg-1单表位的识别滴度;间接免疫荧光反应(IFA)检测小鼠血清抗体对恶性疟原虫天然蛋白的识别滴度;ELISPOT法检测小鼠脾淋巴细胞免疫水平。结果 0.05 mg ALD+M.RCAg-1及0.1 mg ALD+M.RCAg-1组小鼠血清中抗M.RCAg-1的抗体水平均可达1∶10~8;IgG抗体主要以IgG1为主;对M.RCAg-1的11个单个抗原表位(E1~E11)可全部识别;由各表位抗原(除E2外)诱导分泌IL-4的特异性淋巴细胞克隆数明显高于分泌IFNγ的特异性淋巴细胞克隆数(P<0.0001)。0.1 mg ALD+M.RCAg-1组小鼠血清抗体对恶性疟原虫天然蛋白的识别滴度明显高于0.05 mg ALD+M.RCAg-1组(P<0.000 1)。结论 ALD作为恶性疟原虫多表位嵌合抗原M.RCAg-1的佐剂可显著提高其体液免疫及细胞免疫水平。

α-甘露糖肽作为佐剂对恶性疟原虫多表位蛋白疫苗M.RCAg-1免疫原性的影响

目的探讨α-甘露糖肽(α-mannatide)作为佐剂对恶性疟原虫多表位蛋白疫苗M.RCAg-1免疫原性的影响。方法将小鼠随机分为4组:疫苗组(M.RCAg-1)、疫苗佐剂组(M.RCAg-1+α-mannatide)、佐剂对照组(α-mannatide)、弗氏佐剂对照组(M.RCAg-1+Freund’s),分别于第0、14、28天经背部皮下免疫小鼠,0.1 ml/只。采用ELISA法检测3次免疫后小鼠血清Ig G抗体水平、抗体亚型以及血清抗体对单表位的识别,间接免疫荧光反应(IFA)检测抗体对恶性疟原虫天然蛋白的识别,ELISPOT检测其细胞因子的分泌水平。结果 3次免疫后,疫苗佐剂组GMT明显高于疫苗组(P<0.05);疫苗佐剂组GMT与弗氏佐剂对照组持平(P>0.05)。疫苗佐剂组产生的高水平Ig G主要以Ig G1为主。疫苗佐剂组抗体对单表位和天然虫体的识别效果显著。免疫小鼠各表位和蛋白诱发分泌IL-4的特异性淋巴细胞克隆数高于分泌IFNγ的特异性淋巴细胞克隆数(P<0.05)。结论α-mannatide作为恶性疟原虫多表位蛋白疫苗M.RCAg-1的佐剂能诱导其产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答,具有一定的抗疟原虫感染保护作用。

基于人工多表位抗原的恶性疟疾抗血清筛查方法的建立

目的建立基于人工多表位抗原的恶性疟疾抗血清筛查方法。方法以人工多表位抗原M.RCAg-1（malaria random constructed antigen-1）和M.RCAg-3（malaria random constructed antigen-3）作为检测蛋白,建立间接ELISA法和双抗原夹心ELISA法,并对两种方法的抗原包被量、一抗稀释度、封闭液、孵育时间及显色时间进行优化。用两种方法检测恶性疟疾病人和正常人血清抗体水平,比较其敏感度,选出最佳检测方法,并检验其特异性和精密性。结果间接ELISA法最佳检测条件：以0.1μg/孔浓度的抗原包被酶标板120 min,用3%羊血清封闭120 min,加入一抗（1∶200稀释）孵育120 min,加入二抗（1∶20 000稀释）孵育60 min,TMB显色10 min;双抗原夹心ELISA法最佳检测条件：一抗稀释度为1∶20,二抗稀释度为1∶100,其他同间接ELISA法。经敏感性比较,确定以M.RCAg-1为抗原的间接ELISA法为最佳检测方法,且该抗原对间日疟血清抗体无明显交叉反应,该方法的批内和批间精密性试验变异系数（CV）为3.05%-5.82%和4.75%-8.54%,均〈10%。结论单独包被M.RCAg-1的间接ELISA法的检出率高,特异性和精密性良好,操作简便,可用于疫区恶性疟疾的血清流行病学筛查。

葡萄酒的功能因子——白藜芦醇

葡萄酒中的白藜芦醇属于多酚类化合物,具有软化血管,保护心脏,预防癌症的功能。对肿瘤和心脏病的治疗和预防更有明显的作用,因此日益引起人们的关注。