乙醛脱氢酶基因过表达酿酒酵母在黄酒中降高级醇作用

为降低黄酒中高级醇产量,以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)单倍体菌株AY12α为出发菌,利用同源重组技术构建乙醛脱氢酶基因过表达菌株,并在不同黄酒发酵工艺下探究其对酿酒酵母产高级醇的影响。结果表明,成功构建了5株乙醛脱氢酶基因(ALD2、ALD3、ALD4、ALD5和ALD6)过表达菌株,在大米加麦曲的传统黄酒发酵工艺下,所有改造菌株均可以促进乙酸、降低高级醇的生成,其中改造菌株α-ALD6效果最显著(P<0.01),乙酸产量是出发菌AY12α的2.92倍,总高级醇产量下降72.04%。在不同发酵工艺中,改造菌株α-ALD5与α-ALD6均可显著促进乙酸、降低高级醇生成(P<0.01);在纯种根霉曲做糖化剂的发酵工艺中,改造菌株在培菌糖化24 h后接入降高级醇效果更好。与纯种根霉曲相比,改造菌株以麦曲作糖化剂时降高级醇效果更好,且改造菌株α-ALD6在大米加麦曲的传统黄酒发酵工艺下降高级醇效果最好。

17α-羟基黄体酮C11α-羟化菌株的筛选及工艺优化

11α,17α-二羟基黄体酮(11α,17α-dihydroxy progesterone)作为甾体激素类药物的重要中间体,其生物合成主要以17α-羟基黄体酮作为底物转化生成。为探究不同微生物对17α-羟基黄体酮的转化能力,以11株具有甾体羟化能力的菌株为研究对象,通过全细胞生物转化实验,筛选得到了一株转化能力最强的菌株亚麻刺盘孢SF-307。通过单因素实验和正交设计进行菌株发酵培养基组分优化,确定了最适发酵培养基:15 g/L可溶性淀粉、1.8 g/L氯化铵、0.6 g/L氯化镁、3 g/L玉米浆。优化培养基后的亚麻刺盘孢SF-307转化产物唯一,当底物投料量为0.5 g/L,添加1%(V/V)乙醇进行助溶,转化56 h时,底物转化率为93.2%,11α,17α-二羟基黄体酮的最高浓度为224.1 mg/L,较优化前提高61.1%。上述结果表明:亚麻刺盘孢SF-307作为一株全新的17α-羟基黄体酮羟化菌株,发酵优化可显著增强17α-羟基黄体酮转化产物的选择性,缩短转化周期,对11α,17α-二羟基黄体酮的工业生产意义重大。

丝状真菌细胞色素氧化酶CYP-cl3的原核表达

真菌细胞色素P450是一种可催化甾体化合物选择性氧化的膜蛋白.为实现丝状真菌亚麻刺盘孢ST-1(Colletotrichum lini)来源的细胞色素氧化酶CYP-cl3在大肠杆菌中的可溶性表达,通过ProtScale和TMHMM软件预测CYP-cl3的N端膜锚定区,并对其进行不同长度的沉默,分别评估其对CYP-cl3原核表达的影响.筛选获得适宜沉默长度的CYP-cl3重组菌,进一步通过融合增溶标签提高CYP-cl3的溶解性.分别在大肠杆菌BL21(DE3)和C43(DE3)中进行表达.结果表明,CYP-cl3的N端含有一段40个氨基酸残基组成的膜锚定区,可将细胞色素P450锚定于生物膜.当N端被沉默40个氨基酸残基后,CYP-cl3在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达量较未沉默形式显著提高.通过融合MBP标签提高了重组蛋白的溶解性,实现了CYP-cl3在大肠杆菌中的完全可溶性表达.此外,经CYP17A1 N端替换的重组CYP-cl3也在大肠杆菌C43(DE3)实现了可溶性表达.本研究采用N端沉默和N端替换策略实现了CYP-cl3在大肠杆菌系统中的表达,可作为真菌细胞色素P450原核表达的改进策略.(图6表1参23)