体外模拟心肌微环境中人骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化

目的:研究在体外模拟心肌微环境中人骨髓间充质干细胞(hMSCs)向心肌细胞(CM)的分化。方法:体外分离培养扩增hMSCs,进行流式细胞仪分析鉴定其免疫学表型CD34、CD44和CD45,以未加一抗只加二抗的hMSCs作为平行对照组;同时原代培养SD乳鼠的CM以模拟体外心肌微环境。选用生长良好、纯度达到95%的第5代hMSCs,与乳鼠原代培养的CM共培养,并进行心肌特异性标志cTnI的免疫组化鉴定。结果:体外分离纯化培养扩增出的hMSCs,不表达CD34及CD45,高表达CD44,其CD44阳性率平均为(93.26±2.48)%,与平行对照组[(3.42±1.09)%]比较差异有显著性(P<0.01)。hMSCs与CM共培养后,其形态逐渐向CM形态过渡,并表达心肌特异性抗体cTnI。结论:hMSCs在体外模拟的心肌微环境中可分化为CM,干细胞的分化具有环境依赖性。

人骨髓间充质干细胞体外培养扩增及向心肌细胞诱导分化的实验研究

目的:培养人骨髓间充质干细胞(Human mesenchymal stem cell,hMSCs),探讨hMSCs体外向心肌细胞(Cardio-myocytes,CM)定向诱导分化的实验研究。方法:取人的骨髓血,用Percoll(1.073g/ml)密度梯度离心及贴壁筛选结合的方法体外培养扩增hMSCs,并进行流式细胞仪分析鉴定其免疫学表型,以未加一抗只加二抗的hMSCs作为平行对照组。选用生长良好、纯度达到95%的P5代hMSCs,用不同诱导浓度的5-氮杂胞苷(5-Azacytidine)1、5、10和20μmol/L进行诱导,对诱导后的细胞进行心肌特异性标志TroponinⅠ及Desmin的免疫组化鉴定。结果:体外分离纯化培养扩增出hMSCs,其CD44阳性率平均为93.26%±2.48%,与平行对照组(3.42%±1.09%)相比有明显差异(P<0.01)。经5和10μmol/L5-Aza诱导分化的hMSCs表达心肌特异性标记TroponinⅠ、Desmin;10μmol/L5-Aza诱导分化的hMSCs阳性率明显高于5μmol/L组;在20μmol/L组中,诱导后超过50%的细胞脱落死亡。结论:hMSCs可体外分离培养扩增,并具有向心肌细胞分化的潜能,5-Aza最佳诱导浓度为10μmol/L。

红外热成像技术在糖尿病末端血管评价中的意义

目的：探讨红外热成像技术在糖尿病末端血管的评价意义。方法：利用红外热成像检测仪分别采集单纯糖尿病（A组）、合并高血压病的糖尿病（B组）以及正常对照者（C组）远端肢体,以红外表达与分布特性（PDC）及末端血供状态进行综合评价,比较分析3个组的PDC表达差异性。并以病程5年为基线,比较单纯组和综合组中病程与末端动脉闭塞的相关性。结果：所有受检的远端肢体被分为“PDCⅠ-Ⅳ级、0-3分”4种,其中“PDCⅣ级3分”经血管超声检测均证实已为下肢动脉闭塞。3组相比,差异具有统计学意义（χ^2=43.468,P〈0.001）。病程〈5年的单纯组与病程≥5年的综合组相比差异具有统计学意义（χ^2=6.125,P=0.013）。结论：病程≥5年以上且合并高血压病的糖尿病患者末端血供较差,更容易发生血管闭塞,红外热成像检测技术可灵敏地反映糖尿病患者下肢末端的供血状况,具有早期筛查的意义。

人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的超微结构

目的:培养人骨髓间充质干细胞(hMSCs),体外向心肌细胞(CMs)定向诱导分化,进行超微结构观察,为hMSCs体外向CMs诱导分化提供理论依据。方法:体外分离培养扩增hMSCs并进行流式细胞仪分析鉴定;选用生长良好,纯度高的P5代hMSCs,用5-氮杂胞苷(5-Aza,10μmol.L-1)体外定向向CMs诱导分化,对其进行Desmin检测,在倒置显微镜及透射电镜下观察细胞形态学和超微结构。结果:流式细胞仪检测显示体外分离纯化培养扩增出细胞不表达CD34,高表达CD44,表明扩增细胞为hMSCs。hMSCs经5-Aza诱导分化后其形态发生改变,逐渐由长梭形变为多角形及星形,并表达Desmin。透射电镜下可见细胞大小不一致,细胞表面有许多微绒毛;细胞器丰富,胞质内可见丰富的线粒体、粗面内质网;部分细胞内可见大量糖原颗粒沉积,小部分细胞内可见髓样小体;胞浆内可见肌丝样结构,细胞间存在细胞连接。结论:体外分离培养扩增的hMSCs经5-Aza诱导,可分化成具有CMs超微结构特性的心肌样细胞。

正常与损伤条件下乳鼠原代心肌细胞培养上清液对人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的诱导作用

目的体外观察正常及损伤状态下的心肌细胞(CMs)培养上清液诱导人骨髓间充质干细胞(hMSCs)向心肌样细胞分化的作用。方法体外分离培养hMSCs及乳鼠原代CMs,制备正常搏动状态及损伤状态下的CMs培养上清液,分别对传代hMSCs培养诱导27～30d。倒置显微镜观察两组的细胞形态,免疫细胞化学染色检测两组心肌细胞特异性标志物cTnI及Desmin的表达。结果hMSCs经正常搏动CMs上清诱导培养后,只有少数细胞变宽大,部分细胞表达cTnI,但不表达Desmin;经损伤CMs上清诱导培养后,hMSCs变为宽大,大部分细胞表达cTnI,部分细胞表达Desmin。定量分析,正常与损伤状态下培养上清液诱导细胞表达cTnI、desmin的阳性百分比及阳性表达强度OD值均有非常显著性差异(P<0.01)。结论正常与损伤状态下CMs培养上清液均可诱导hMSCs向心肌样细胞分化,CMs损伤状态下的细胞培养上清液更有利于促进其分化。

某部新兵集训期女新兵头颈部红外热像分析

目的评价新兵集训期间应激状态下女新兵上呼吸道系统的健康状况。方法应用红外热成像检测仪,采集集训期间的健康女新兵头颈部的红外热像图57例,分别对头面部整体区域及局部区域进行定位定量分析,进行上呼吸道状态评价。结果头颈部的整体红外热成像表达基本呈左右对称性分布,正中矢状线两侧额窦区、眼内眦眶区、鼻窦区、口角及颈部咽喉区的最高温、最低温及平均温的比较,左右温差最大不超过0.21℃(均P>0.05)。头颈部的局部红外热像表达显示:额、鼻及眼部的红外热像表达相对正常,但口与颈咽喉部呈现出异常高温的红外热像表达;温度定量分析显示:头面部整体平均温度为(31.51±0.77)℃,与之相比,额部平均温最高(33.25±0.52)℃,鼻部平均温最低(30.83±1.49)℃;而颈部、眼部及口部的平均温分别为(32.65±0.62)℃、(32.79±0.50)℃和(32.77±1.03)℃,三者间比较无统计学意义(P>0.05),但三者与面部、额部及鼻部比较差异有统计学意义(均P<0.01)。结论女新兵在集训期应激状态下,其口与颈咽喉部呈现出异常的红外热像图表达,表明上呼吸道(口咽部及颈咽喉部)局部组织容易发生充血和水肿。

人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的动作电位观察

目的观察诱导分化为心肌样细胞的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)是否可产生动作电位。方法体外分离培养hM-SCs,5-氮胞苷诱导向心肌细胞(CMs)分化。分别以体外分离培养的原代搏动的CMs和同代次的hMSCs为阳性对照和阴性对照,利用膜片钳技术观察动作电位。结果在30个诱导分化成心肌样细胞的hMSCs中有6个细胞可诱发出动作电位;CMs具有典型的动作电位;未经诱导的hMSCs没有引出动作电位,5-氮胞苷诱导后细胞可以引出微弱的动作电位。结论实验结果表明hMSCs经5-氮胞苷诱导后,在电学特性方面具有向CMs分化的潜能;与CMs具有的电生理特性相似,这些心肌样细胞具有兴奋性。

人骨髓间充质干细胞在心肌损伤裸鼠体内的归巢与分化

目的:探讨在心肌细胞移植中机体内环境因素对人骨髓间充质干细胞(MSC)向心肌细胞(CM)定向分化的影响。方法:取人骨髓血,用Percoll(1 073 g/L)进行密度梯度离心及贴壁筛选结合的方法,体外培养扩增人骨髓MSC,以流式细胞仪鉴定其纯度,并进行免疫细胞化学染色。随后将人骨髓MSC植入异丙肾上腺素所致急性心肌损伤的裸鼠体内。3周后,取心脏组织块进行免疫组织化学染色检测。结果:体外分离纯化培养扩增的人骨髓MSC,可高表达CD44,CD105和波形蛋白,不表达CD31,CD34,CD45,肌钙蛋白I和结蛋白。细胞移植3周后,人骨髓MSC在心肌损伤区域均能分化为表达肌钙蛋白I,结蛋白和波形蛋白的细胞。结论:体外分离培养扩增的人骨髓MSC可归巢于受损心脏,并参与体内心肌损伤的修复,具有向CM分化的潜能。

二种不同的诱导方法诱导人骨髓间充质干细胞分化的心肌样细胞L型钙电流的变化

目的利用膜片钳技术检测体外两种不同诱导方法诱导人骨髓间充质干细胞(hMSCs)分化为心肌样细胞的L型钙电流(ICa-L)。方法体外培养扩增hMSCs,采用①5-氮胞苷(5-Aza,10μmol/L)化学诱导4周;②原代分离培养SD乳鼠搏动心肌细胞(CMs)制备的心肌微环境诱导10天直至CMs停止搏动。利用膜片钳技术检测两种不同方法诱导分化的心肌样细胞、hMSCs及原代CMs的ICa-L。结果 5-Aza与心肌微环境诱导分化的心肌样细胞较hMSCs的ICa-L增强(112.60±8.26,120.50±9.35pAvs96.67±13.50pA,P均<0.05);低于CMs组(263.86±39.01pA,P<0.01)。结论两种诱导方法诱导的心肌样细胞ICa-L均增强。

红外热成像技术在兔股静脉结扎模拟静脉完全栓塞模型中的应用价值

目的探讨红外热成像技术(IRTI)在新西兰白兔股静脉结扎所致静脉完全栓塞模型中的应用价值。方法利用经典股静脉结扎法构建新西兰白兔后肢股静脉完全栓塞模型,所有模型均以右侧结扎,左侧假手术对照,分别在术前、术后即刻、术后12 h和术后48 h采集外周血,ELISA方法进行炎症因子白细胞介素(IL)-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的检测;分别在术前(T1)、术后即刻(T2)及术后48 h (T3) 3个时点行IRTI并分析;并在T3时点检测完毕后处死兔,观察双侧股静脉并取材,进行核因子-κB(NF-κB)的免疫组化检测。结果所有实验兔右侧后肢均略有肿胀且活动略有受限。不同时间点外周血炎症因子差异无统计学意义(P> 0. 05),但是实验侧股静脉局部有炎症因子NF-κB阳性表达。红外热成像表达显示,在T1时点,两侧红外表达基本呈相对对称性分布; T2时点,两侧的体表温度均较T1时点降低,但双侧表达呈不对称性分布,呈现出结扎侧较对照侧异常温度增高的红外热像轨迹; T3时点的红外辐射轨迹与T2时点相似,呈现典型的不对成性,但是,对照侧红外表达已经与T1期相吻合,而结扎侧则出现更为显著的异常高温。结论兔股静脉结扎型所致的经典的完全性栓塞中不会导致外周血炎症因子水平的增高,但局部组织会有炎症反应;而红外检测具有典型的红外热成像轨迹特征表达,将有助于深静脉血栓形成的诊断与早期发现。

免疫缺陷裸鼠无创性心肌缺血缺氧损伤模型的构建

目的:通过对免疫缺陷裸小鼠腹腔注射异丙肾上腺素,构建一种无创性裸小鼠的心肌缺血缺氧损伤模型。方法:16只免疫缺陷裸小鼠随机分为3组:对照组5只,实验A组7只,实验B组4只,其中实验A、B组连续3d重复腹腔注射5mg/kg异丙肾上腺素,对照组则注射等量生理盐水。对照组和实验A组于第3次注射后24h处死,实验B组则于第3次注射后2周处死。各组裸小鼠处死前取血清进行心肌酶检测,心脏标本称重,常规HE染色。结果:实验A组、B组、对照组的心脏质量分别为(94.97±6.12)mg、(79.35±7.63)mg、(81.38±10.11)mg,A组相对于B组、对照组,差异均具有统计学意义(P<0.01)。HE染色显示A组局部心肌组织损伤与变性坏死,而B组病变程度明显较轻,未见斑痕形成。实验A组、B组、对照组的乳酸脱氢酶(LDH)分别为(6662.70±884.78)U/L、(4096.75±448.75)U/L、(4419.40±880.50)U/L,A组相对于B组、对照组,差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论:腹腔反复大剂量注射异丙肾上腺素可构建免疫力缺陷裸小鼠的心肌缺血缺氧损伤模型。

人骨髓间充质干细胞体外诱导分化成心肌细胞及其在心肌细胞移植术中的潜能性研究

目的培养人骨髓间充质干细胞(humanmarrowmesenchymalstemcell,hMMSCs),体外诱导分化成心肌细胞(cardiomyocytes,CM),将细胞移植入裸鼠皮下,观察其在细胞移植中有无成瘤改变,是否具有细胞移植的潜能性。方法体外培养扩增hMMSCs,流式细胞仪鉴定其纯度;用5-氮杂胞苷(5-Aza,10μmol/L)体外诱导成CM,并进行鉴定;将诱导成CM的hMMSCs接种于裸鼠皮下,移植后18d分别取接种局部皮下及心肌组织,进行组织化学染色。结果体外培养扩增出hMMSCs,流式细胞检查CD44阳性,表达Vimentin;hMMSCs经5-Aza诱导可分化成CM,表达心肌特异性标记TroponinⅠ及Desmin,透镜观察可见肌丝样结构;进行细胞移植的裸鼠注射局部皮下组织没有形成结节样结构,但发现有表达TroponinⅠ、Desmin及Vimentin的细胞;此外,在心肌组织中也发现有表达这三种抗体的hMMSCs。结论hMMSCs可体外分离培养扩增,具有向CM分化的潜能,体外诱导分化成CM的hMMSCs在细胞移植中并没有成瘤性,且经皮下细胞移植诱导分化成CM的hMMSCs具有向心脏归巢的现象,可用于心肌损伤的细胞移植。

人骨髓间充质干细胞的体外多向分化潜能

目的体外观察人骨髓间充质干细胞(hMSCs)向成骨细胞、脂肪细胞及心肌细胞的分化。方法体外培养扩增hMSCs,流式细胞仪分析其免疫表型。取稳定传代的hMSCs,分别在体外向成骨细胞、脂肪细胞及心肌细胞分化,并采用碱性磷酸酶染色、油红O染色及PTAH染色鉴定3种诱导分化后的细胞。结果 hMSCs传代后形态上为典型的成纤维细胞样结构;流式细胞仪检测表明,hMSCs表达CD44、CD105,不表达CD31、CD34和CD45;hMSCs诱导分化后,细胞化学染色显示呈阳性表达的成骨细胞、脂肪细胞和心肌细胞。结论 hMSCs具有多向分化潜能,可向成骨细胞、脂肪细胞和心肌细胞分化。

人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞的L型钙通道研究

目的:观察人骨髓间充质干细胞(hMSCs)诱导分化为心肌样细胞的电生理特征,L型钙离子通道的电流强度。方法:体外分离培养hMSCs,以5-氮胞苷诱导分化为心肌样细胞。分别以体外分离培养的原代搏动的SD乳鼠心肌细胞(CMs)和同代次的hMSCs为阳性对照和阴性对照,利用膜片钳技术观察诱导分化为心肌样细胞的电生理特征L型钙离子通道的电流强度。结果:在20个心肌样细胞中,有6个细胞可记录到对硝苯地平敏感的内向钙电流,其最大内向峰值电流(ICa-Peak)在0mV为(112.60±8.26)pA;而hMSCs和乳鼠的CMs的ICa-Peak分别为(96.67±13.50)pA和(263.86±39.01)pA(n=6),将诱导的心肌样细胞与未经诱导的hMSCs的ICa-Peak进行比较,P<0.05具有统计学意义。结论:hMSCs经5-氮胞苷诱导后,其L型钙离子通道的钙电流增加,在电生理特性上具有向CMs分化的潜能。

人体上呼吸道热态快速自动评测系统对上呼吸道炎症筛查的可行性分析

目的:探讨人体上呼吸道热态快速自动评测系统对上呼吸道炎症筛查的可行性。方法:利用红外热成像技术(IRTI)采集集训期间170名新兵头颈部的红外热像图,采用人体上呼吸道热态快速自动评测系统对受试者的上呼吸道红外热图进行自动评判,与临床问诊及体检进行比较,并进行敏感度、特异度、预检率、假阳性、假阴性和诊断符合率的评价。结果:人体上呼吸道热态快速自动评测系统自动评判结果显示,阴性表达84例、阳性表达86例;临床问诊和体检结果显示,有症状者93例、无症状者77例。人体上呼吸道热态快速自动评测系统对上呼吸道炎症筛查的敏感度为79.57%、特异度为84.42%、阳性预检值为86.05%、阴性预检值为77.38%、假阳性和假阴性分别为20.43%和15.58%,诊断符合率为81.76%。结论:人体上呼吸道热态快速自动评测系统具有较好的应用价值。

体外自发性搏动乳鼠原代心肌细胞的分离培养及超微结构

目的:通过对SD乳鼠体外自发性搏动的心肌细胞(CMs)分离培养,并观察其超微结构,以了解心肌干细胞的特性。方法:用体外分离、纯化培养SD乳鼠自发性搏动的心肌细胞,应用倒置显微镜及透射电镜观察其形态结构与超微结构,并进行心肌特异性标志troponin I(cTnI)的免疫细胞化学鉴定。结果:体外分离、纯化培养出心肌细胞,细胞具有自发性搏动特性,表达心肌特异性抗体Tropnin I。电镜下可见细胞内出现肌丝样结构及Z线结构,细胞普遍存在肌小节,细胞间有闰盘连接;部分细胞表面有大量微绒毛,细胞器丰富,可见内质网、线粒体。结论:体外可分离培养扩增出自律性搏动的CMs,这些细胞表现增殖活跃,具有干细胞的增殖旺盛特性。

新西兰白兔股静脉局部单纯注射脂多糖构建股静脉血栓形成模型的实验研究

目的:通过兔股静脉局部单纯注射脂多糖构建股静脉血栓造模探讨炎症在静脉血栓形成中的作用。方法:选新西兰大白兔9只,于其股三角区局部分离股静脉,均以左侧为实验侧,右侧为假手术侧。无齿血管夹暂时阻断血流、股静脉局部注入脂多糖、30 min后去血管夹、逐层缝合皮肤,并将实验兔分为外科小夹板固定组(n=5)和非固定组(n=4)两组。造模72 h后进行血管加压超声检测确定栓塞的情况,检测结束后处死兔,迅速取实验段的股静脉进行病理学检测。结果:除固定组1只兔于60 h后死于肺栓塞外,其余8只兔存活;血管超声检测8只兔实验侧可见明确的血栓形成,而对照侧血流通畅,未见血栓形成;病理学HE检测显示所有兔的实验侧股静脉管壁均有不同程度的增厚和炎细胞浸润,除固定组1只兔未形成血栓形成外,8只兔实验侧均可见明显的血栓形成,而对照侧均未见血栓形成及炎细胞浸润。固定组与非固定组相比,差异无统计学意义。结论:炎症在深静脉血栓形成中具有重要意义,是血栓形成的最直接原因,股静脉单纯注射脂多糖可以导致血栓形成。

Transwell侵袭小室技术的改良及其在人骨髓间充质干细胞诱导分化中的应用

目的:分离、培养和鉴定人骨髓间充质干细胞(Mesenchymalstemcells,MSCs),应用改良的Transwell侵袭小室技术,探讨血管内皮生长因子(VEGF)及内皮细胞条件诱导液对其体外诱导分化中的作用。方法:采用Percoll(1·073g/ml)分离液分离骨髓单个核细胞,体外培养MSCs,流式细胞术分析鉴定MSCs的纯度,Transwell侵袭小室技术结合LSCM,实时监测MSCs在Matrigel与VEGF/内皮细胞条件诱导液构成的内皮细胞生长微环境中的运动迁移情况。结果:经Percoll分离、体外培养扩增的MSCs,细胞纯度可达95%左右;VEGF组迁移的深度虽高于对照组(P<0·05),但迁移至聚碳酸脂膜下的细胞与对照组相比,并无统计学意义(P>0·05)。内皮细胞条件诱导液促进MSCs的迁移,在Matrigel内迁移的深度及迁移至聚碳酸脂膜下的细胞均明显多于对照组(P<0·05)。结论:共聚焦激光扫描显微术与Transwell侵袭小室技术的结合,能够从时间和空间上对后者进行观察,使该实验得到改良;利用内皮细胞条件诱导液与Matrigel模拟体外内皮细胞生长的微环境,并从空间上观测了MSCs穿越人工基底膜的情况,为MSCs向内皮细胞体外诱导开辟了新的思路。

红外热成像在腰椎间盘突出症诊断中的地位

目的探讨红外热成像在腰椎间盘突出症诊断中的地位。方法选出25例符合腰椎间盘突出症的患者,经CT、MRI检查确诊,且有明显腰腿痛表现或体检疼痛的阳性体征。运用红外热像仪采集患者背面腰背部及双下肢的红外热像图,观察并对比分析患者的病变部位、范围。结果所有患者的热像图呈现明显不对称性,脊柱力线断续不完整,色彩不均匀;脊柱两侧局部呈现明显片状的高温或低温区;腰骶部菱形窝呈非对称性红色或深红色,热区范围增大。所有患者红外热图异常表达区域与CT、MRI检测结果基本一致,与患者自诉疼痛区域相符,23例与体检体征相符。结论热像图可客观地显示出病变及疼痛的部位、区域范围,在腰椎间盘突出症患者的辅助诊断中有重要价值,可以用作腰椎间盘突出症的一项客观检查指标,以补充和完善CT、MRI的局限性。