砷诱发氧化应激研究现状

目前,世界范围内有近2亿人通过饮水和饮食暴露于具有毒性危险的砷,慢性砷中毒已经成为严重威胁人类健康的全球性的公共卫生问题。砷作为确认的人类致癌物,其毒性作用具体分子和细胞机制尚不清楚,氧化应激是目前被广泛接受与研究的砷毒性作用机制。本文主要综述了砷诱发活性氧的生成、相关生物标志和砷对抗氧化酶以及抗氧化防御系统作用的相关研究进展。

人重组皮肤模型评价手消毒剂产品皮肤刺激性的应用研究

采用人重组皮肤模型(EpiSkin^(TM))作为实验模型,通过联合测定细胞活性和白介素-1α(IL-1α)来综合评估14个市售手消毒剂产品的皮肤刺激性,其中4个免洗型产品暴露4 h,10个非免洗型产品分别暴露2 h和4 h,将得到的结果分别与动物试验(Draize试验)结果进行对比。结果显示,在皮肤刺激性试验中,经Draize试验判定为中刺激性的两个产品,人重组皮肤模型均能有效鉴别。采用上样时间4 h,14个产品的人重组皮肤模型和动物试验结果的准确度为57.1%、特异度为50%。对其中10个非免洗型产品采用2 h上样,其准确度可达到71.4%、特异度可提高至66.7%。研究表明,人重组皮肤模型在手消毒剂产品的皮肤刺激性评价中具有一定的可行性,根据产品的使用特性进行暴露时间的优化可为消毒剂产品皮肤刺激体外测试标准方法的建立提供实验室依据。

长期低剂量亚砷酸钠染毒对人支气管上皮细胞和人角质形成细胞增殖的影响

目的探讨1.0μmol/L亚砷酸钠慢性染毒对人支气管上皮细胞(HBE)和人角质形成细胞(Ha Ca T)体外增殖的改变及其调控机制。方法以体外培养的HBE和HaCaT细胞恶性转化模型为研究对象,应用MTT法检测细胞增殖情况,采用流式细胞仪检测细胞周期改变,利用Western blot检测细胞周期相关蛋白cyclin E、cyclin D1、cylin A蛋白的表达。结果染砷组HBE细胞36代和43代、HaCaT细胞28代和35代相对增殖率均高于传代对照组(P<0.01和P<0.05);细胞周期G1期细胞比例下降(P<0.05),S期细胞比例上升(P<0.05);此外,细胞周期相关蛋白cyclin E表达升高(P<0.05),并在晚期持续性高表达。结论低剂量亚砷酸钠可通过上调HBE和Ha Ca T细胞中cyclin E的表达从而使细胞从G1期逃逸至S期,加速细胞增殖,最终导致细胞发生恶性转化。

长期低剂量亚砷酸钠对永生化人皮肤角质形成细胞凋亡的影响

目的观察1．0μmol／L亚砷酸钠（NaAsO2）长期作用于永生化人皮肤角质形成细胞（HacaT）时，细胞凋亡及凋亡相关蛋白的动态变化。方法用1．0μmol／LNaAsO2长期作用HaCaT细胞成功建立恶性转化模型，收集细胞恶性转化模型建立过程中0、1、7、14、21、28、35代细胞。采用流式细胞仪检测细胞凋亡率，蛋白免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白，包括活化的半胱氨酸蛋白酶3、8（cleaved—caspase-3、8）、转录因子C／EBP的同源蛋白（Chop）、淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）。结果随着染砷代数的增加，细胞凋亡率呈明显的下降趋势，各代数间比较差异有统计学意义（F=26．770，P〈0．05），其中染砷第7、14、21、28、35代细胞的凋亡率（0．307±0．049、0．213±0．055、0．163±0．057、0．147±0．035、0．053±0．012）低于对照组0代（0．393±0．021，P均〈0．05）。染砷组促凋亡的cleaved—caspase-3、Chop、Bax蛋白和抗凋亡的Bcl-2蛋白表达各代间比较，差异有统计学意义（cleaved—caspase-3：1．000±0．000、1．030±0．027、1．104±0．069、1．016±0．087、0．838±0．075、0．753±0．082、0．677±0．073；Chop：1．000±0．000、1．059±0．018、0．934±0．095、0．976±0．216、0．793±0．136、0．651±0．042、0．564±0．056；Bax：1．000±0．000、1．069±0．037、1．028±0．042、0．954±0．118、0．641±0．135、0．531±0．132、0．429±0．085；Bcl-2：1．000±0．000、1．072±0．023、1．249±0．134、1．334±0．143、1．633±0．221、1．507±0．152、1．461±0．145．F=7．730、7．355、27．802、12．438，P均〈0．05），且21代及以后与对照组0代（1．000±0．000）和同代对照组（1．000±0.000）比较，差异有统计学意义（P均〈0．05）；而cleaved．caspase-8蛋白各代间比较，差异无统计学意义（F=0．832，P〉0．05）。结论低剂量NaAsO：可能通过作用于线粒体和内质网凋亡通路抑制HaCaT细胞的正常凋亡而使其发生恶性转化。

丝素肽对过氧化氢致A549细胞损伤的修复作用

[目的]探究丝素肽(SF)对过氧化氢(H2O2)致人肺癌(A549)细胞损伤的修复作用。[方法]将细胞分为空白对照组,H2O2组(600μmol/L),SF前处理组(10、20、30、50 mg/m L SF预孵育24 h再加600μmol/L H2O2损伤24 h),SF后处理组(600μmol/L H2O2损伤24 h再加10、20、30、50 mg/m L SF孵育24 h)及阳性对照前、后处理组[抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)]。用MTT法测定细胞活力,生物化学法测定细胞中丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的含量和总抗氧化能力(T-AOC)。[结果]H2O2组细胞活力为(46.67±2.19)%,MDA含量为(64.31±3.22)nmol/mg(以蛋白计)。与H2O2组相比,前处理组和后处理组中细胞活力增加,而MDA含量降低(P<0.05);SF后处理组细胞活力的增加和MDA含量的降低更明显(P<0.05);尤其50 mg/m L SF后处理组比前处理组细胞活力增加值高2.33%,而MDA含量降低值少44.51 nmol/mg(以蛋白计)。H2O2组中SOD、CAT活性和T-AOC都明显降低(P<0.05),SF后处理明显提高SOD、CAT活性和T-AOC水平(P<0.05)。[结论]SF对H2O2致A549细胞损伤有修复作用,部分原因可能是由于其可增加细胞活力和提高细胞中抗氧化酶活性。

重组人皮肤模型在化妆品皮肤刺激性评价中的应用研究

目的探讨重组人皮肤模型应用于化妆品体外皮肤刺激性评价的可行性。方法以重组人皮肤模型(EpiSkinTM)为受试模型,在对10个已知刺激性分类的标准化学品进行方法验证的基础上,再根据化妆品的使用特性对23个产品进行皮肤刺激性分类评价,其中6个基础型化妆品和10个美容型化妆品暴露18 h、7个清洁型化妆品分别暴露18、4和2 h,检测终点为MTT试验测定细胞活性,并以细胞相对存活率50%为判定依据来分类刺激性和非刺激性物质。分类评价结果同步与本实验室传统Draize兔皮肤刺激性试验历史数据进行一致性比较。结果23个测试产品在暴露时间为18 h的预测性达到73.9%,其中16个基础型和美容型化妆品的预测性可达到100%,而7个清洁型化妆品的预测性仅为14.3%。针对清洁型化妆品缩短上样时间(参照Draize兔皮肤刺激性试验方法),结果该类产品暴露4 h的预测性可提高至42.9%,暴露2 h的预测性可达到100%。结论基于EpiSkin^(TM)的皮肤刺激性体外替代方法(18 h上样)可用于对护肤类和彩妆类化妆品的评价,但全面推广至化妆品的评价尚有局限性,仍需对产品的上样时间进一步研究和摸索。

抗氧化性丝素蛋白水解产物的生产工艺及其改善过氧化氢所致HepG2细胞损伤机制

目的:抗氧化性丝素蛋白(SF)胰酶水解工艺的优化。研究水解物对过氧化氢(H2O2)造成人肝癌Hep G2细胞损伤的改善作用,对其机制进行初步探讨。方法:以超氧自由基清除率为指标,设计正交试验考察丝素蛋白胰酶水解过程中反应时间、p H、温度、底物浓度、酶浓度对水解工艺的影响。测定水解产物的分子量分布及其对羟基自由基清除率和H2O2诱导的红细胞氧化溶血抑制率。用不同浓度H2O2处理细胞24 h,测定细胞活性,选择合适浓度的H2O2损伤细胞。然后再将细胞分为空白组(不加药物处理),H2O2损伤组,H2O2损伤+5 mmol·L-1N-乙酰半胱胺酸(NAC)治疗组,H2O2损伤+10,20,30,50 g·L-1SF治疗组。观察细胞活性,丙二醛(MDA)含量,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,超氧化物歧化酶(SOD)活性,过氧化氢酶(CAT)活性和总抗氧化能力(T-AOC)的变化。结果:最佳水解工艺是酶浓度6%,反应时间160 min,底物质量浓度20 g·L-1,p H 8,温度38℃,此水解条件下所得水解液对超氧自由基清除率为72.73%,水解物分子量在10 k Da以下,对羟基自由基清除率和红细胞氧化溶血抑制率均提高。H2O2损伤细胞后细胞活性降低并且细胞中MDA含量增加(P<0.05)。与H2O2损伤组比较SF治疗组中细胞活性升高,MDA的含量也降低(P<0.05)。H2O2损伤细胞后,TNF-α含量上升,SOD,CAT的活性和T-AOC能力均下降(P<0.05),SF治疗能降低TNF-α含量,提高SOD,CAT分泌量和增强T-AOC能力(P<0.05)。结论:抗氧化性丝素蛋白水解物对过氧化氢致Hep G2细胞损伤有改善作用,机制是通过降低TNF-α含量,提高细胞活力和增加细胞中抗氧化酶活性。

慢性砷暴露对人支气管上皮细胞超微结构的影响

目的研究长期亚砷酸钠诱导人支气管上皮细胞(HBE)恶性转化过程中线粒体及其他细胞器超微结构的改变,为砷致癌的机制研究提供动态细胞形态学改变基础资料。方法用1.0μmol/L亚砷酸钠连续染毒HBE细胞至43代,分别取正常和亚砷酸钠暴露1、8、15、22、29、36、43代HBE细胞,用流式细胞仪和生化法分别检测不同组别细胞内活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力的变化,用透射电镜观察亚砷酸钠暴露15、29、43代和传代对照的HBE细胞内各细胞器超微结构的改变,用real-time PCR检测不同组别细胞内线粒体DNA(mtDNA)拷贝数的变化。结果与正常HBE细胞(0代)比较,亚砷酸钠染毒组22代及以前的ROS、MDA及SOD水平均呈先升高后下降的趋势;染毒29代及以后的ROS、MDA水平逐渐下降,SOD水平逐渐升高。透射电镜观察,与传代对照组细胞比较,染毒15代细胞的线粒体开始出现肿胀,嵴模糊,内质网扩张,且细胞mtDNA拷贝数增加;染毒29代及以后线粒体肿胀明显,嵴断裂,呈明显空泡状态,且有膜增殖、盘绕现象,mtDNA拷贝数先降低后升高,且均高于传代对照,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 1.0μmol/L亚砷酸钠在诱导HBE细胞恶性转化的过程中发生了细胞内氧化-抗氧化状态失衡,且随着染毒代数的增加,细胞线粒体DNA拷贝数增加明显,超微结构观察有细胞内线粒体肿胀、内质网扩张及膜增殖等变化。