甘蔗抗虫转基因研究进展

甘蔗是世界最重要的糖料作物,但日益严重的虫害给甘蔗产量及品质造成了重大损失。目前甘蔗抗虫转基因育种已成为甘蔗抗虫育种最有效的途径之一。近年来,美国、澳大利亚、巴西、南非、古巴、泰国、印度、新加坡、中国及一些国际大型公司等都相继开展了甘蔗抗虫转基因研究,主要集中于转Bt基因、GNA基因、PI基因等甘蔗材料的筛选,并获得一批抗蔗茎螟的CryⅠA(b)转化植株、抗Chilo infuscatellus的转Cry1Ab基因甘蔗植株、抗绵蚜的转GNA基因甘蔗植株、抗甘蔗白螟的转PⅠ基因甘蔗植株、抑制蛴螬幼虫生长的转PiⅡ和GNA基因甘蔗无性系G87、UP87及600多份转cry1C*基因甘蔗无性系,部分学者还对转Bt基因甘蔗植株的生理、抗虫性和农艺性状进行了研究。由于抗虫转基因甘蔗研究起步晚,受抗虫基因来源及知识产权保护等方面的限制,其研究进展缓慢,目前尚未培育出优良的甘蔗抗虫品种并推广种植。今后需对外源基因在转基因甘蔗无性后代中的整合、遗传表达特性及甲基化修饰等影响表达的各种因素进行综合研究,提高外源基因在甘蔗无性繁殖中遗传和表达的稳定性;此外,还需对抗虫转基因甘蔗的抗虫机理进行系统、深入的研究,为筛选出优良的、稳定遗传的抗虫甘蔗品种并在生产中推广应用提供理论依据和育种材料。

融合杀虫基因对甘蔗的遗传转化

【目的】利用MAR序列介导转基因表达及融合杀虫基因,以期克服外源基因失活,增强抗虫基因表达能力,延缓昆虫抗性的发生,获得高抗虫转基因甘蔗植株。【方法】以甘蔗品种ROC25为材料,进行愈伤组织、芽苗分化和生根的Hyg抗性筛选试验。利用农杆菌介导,将含MAR序列介导融合杀虫基因(AVAc-CpTI)导入甘蔗基因组。【结果】愈伤组织增殖、出芽时Hyg的最佳筛选浓度为50mg/L,生根时Hyg的最佳筛选浓度为30mg/L。获得13个MAR序列介导转基因表达基因系,48株Southern杂交阳性甘蔗植株;获得8个无MAR序列介导转基因表达基因系,7株Southern杂交阳性甘蔗植株。MAR序列介导转基因表达使转化过程中转基因系的获得数量提高了62.5%。【结论】建立了ROC25的潮霉素抗性筛选体系;MAR序列介导融合杀虫基因进行甘蔗遗传转化,可提高甘蔗外源基因转化效率。

MAR序列介导野苋菜凝集素基因在白菜中的表达

以‘丰顺’白菜带柄子叶为转化受体,用带有MAR(Matrix Attachment Region)和不带MAR的两种植物表达载体进行农杆菌介导转化野苋菜凝集素基因(Amaranthus viridisL.agglutinin,AVA)获得转基因的抗蚜小白菜。分析MAR序列介导对转基因表达的影响。表明利用MAR序列介导AVA基因表达,获得转基因植株的数量比对照提高29.63%;转AVA基因白菜对桃蚜(Myzus persicae)的群体发展有一定的抑制作用,平均抑制率为55.8%;MAR序列介导AVA基因表达的转基因植株中,该基因的表达水平比对照高,并且不同转基因单株间AVA基因表达差异比对照小。

野苋菜凝集素基因的克隆及抗蚜性

通过PCR从苋科植物野苋菜Amaranthus viridis L.基因组DNA中扩增出野苋菜凝集素的核基因片段AVA。序列分析结果表明该基因为1831 bp,含有一个922 bp的内含子和两个分别为212 bp和697 bp的外显子。采用反向PCR技术获得了该基因的编码区克隆。分别构建含有内含子和不含内含子的AVA基因植物表达载体pBI121AVA-GUS和pBI121AVAc-GUS,通过根癌农杆菌介导法转化烟草。PCR、GUS检测结果均表明AVA基因不仅已整合到烟草基因组DNA中,而且初步表明转基因烟草有AVA蛋白表达。抗蚜实验表明含内含子和无内含子的AVA基因在转基因烟草中的抗蚜能力不同,转AVA和AVAc烟草对蚜虫的抑制率分别为60.81%和50.63%,有的植株高达97%。实验结果表明所克隆的AVA基因是具有抗蚜能力的苋菜凝集素基因家族中的新成员。

小白菜高效子叶离体植株再生体系的建立

以丰顺小白菜带柄子叶为外植体，研究了苗龄、不同激素配比、AgNO3浓度和抗生素、共培养时间对不定芽再生的影响。结果显示，子叶不定芽再生的最佳苗龄为5～9d；经过2d的预培养，在MS＋1．0mg／L TDZ＋0．1mg／LNAA＋7．5mg／LAgNO3＋0．5mg／LABA培养基中，带柄子叶不定芽再生率最高，为82．53％；在含有2．0mg／LIBA的1／2 MS0培养基中诱导生根，不定根形成率为100％。抗生素敏感性试验表明，可选择浓度为20mg／LHyg（潮霉素）作为最适合选择压，抑制农杆菌生长的抗生素选用500mg／LCb（羧卞青霉素）。不同浓度农杆菌菌液对子叶再生不定芽的影响不大，但共培养时间的长短却明显地影响不定芽的分化。

杀虫基因高效植物表达载体的构建

以质粒pCAMBIA1200、pBI121、pMMAR和pC1300MAR为基础,通过酶切连接,构建植物中间载体pC2MARHyg;再利用pAVAc质粒、载体pGA1611和中间载体pC2MARHyg,构建含有Ubi-1启动子、顺向重复MAR和杀虫基因AVAc的高效植物表达载体pC2MAR-AVAc,然后转化农杆菌EHA105,经筛选鉴定获得阳性克隆,为进一步开展植物抗虫基因工程研究奠定基础。

DNA分子进化研究进展

分子进化和重组技术在蛋白质体外进化工程中占据着越来越重要的地位,它可以对单一基因、质粒、代谢途径、部分甚至整个基因组进行改造,从而在较短时间内获得漫长自然进化过程无法得到的具有特定性质的基因、蛋白质甚至物种。文章通过综合概括各种DNA分子进化技术的原理、特点,并介绍这些技术的应用研究进展以及最新研究方向,促进其在提高酶活性、蛋白质产量和改善蛋白质(酶)的性能等方面广泛应用。

豌豆MAR的分离及其功能分析

从3个不同品种豌豆中分离获得3个具有MARs序列特征的DNA片段MMAR、DMAR、HMAR。根据GenBank同源性搜索结果,发现这些片段均为未注册的DNA序列。经转化烟草并测定其GUS活性,结果发现两侧顺式重复连接MAR对外源基因的表达具有明显的增强作用,MMAR、HMAR和DMAR均不同程度提高了GUS的表达,分别为载体对照植株的4.16、3.66和2.08倍,但不同转化体间表达水平差异仍比较明显。

干旱后复水对甘蔗伸长期生理生化特性的影响

【目的】研究干旱后复水对甘蔗生理生化特性影响,进一步揭示甘蔗受水分胁迫的响应机理,为甘蔗抗旱育种和甘蔗抗旱遗传改良研究提供参考依据。【方法】以桂糖11号为材料,在温室人工控水条件下,测定干旱及复水后叶片脯氨酸、丙二醛(MDA)、超氧阴离子、可溶性糖、脱落酸(ABA)和可溶性蛋白质含量及脯氨酸脱氢酶(Pro DH)、Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽还原酶(GSH-R)、多胺氧化酶(PAO)活性等生理指标,探讨甘蔗伸长期在水分胁迫下生理响应机理。【结果】在干旱胁迫下,除可溶性蛋白含量和Pro DH活性外,GT11叶片MDA、可溶性糖、超氧阴离子、脯氨酸、ABA含量及POD、CAT、SOD、GSH-R、P5CS和PAO活性均明显高于对照处理;复水后,除可溶性蛋白含量和CAT、SOD活性外,叶片中其他生理指标均逐渐下降至稍高于对照水平。在甘蔗伸长生长期,随着干旱胁迫的加重,GT11叶片中超氧阴离子、MDA、脯氨酸、可溶性糖和ABA含量均呈不同程度的增加趋势,POD、PAO和GSH-R等酶活性明显上升,而可溶性蛋白质含量和CAT活性下降,P5CS、Pro DH活性被抑制。恢复供水后,甘蔗叶片中超氧阴离子、MDA、ABA和脯氨酸含量及P5CS、POD、SOD、GSH-R和PAO等酶活性出现不同程度下降,而可溶性蛋白质含量和CAT活性出现上升;可溶性糖含量呈先下降后上升的变化趋势,Pro DH活性则呈先上升后下降的变化趋势。【结论】在伸长期干旱胁迫条件下,抗旱甘蔗品种GT11具有较强的生理调控和自我修复能力,其膜损伤、渗透调节、保护酶系统、内源激素等均对干旱胁迫有积极的响应。

甘蔗蔗糖磷酸合成酶SPSⅢ基因表达的初步研究

【目的】了解蔗糖磷酸合成酶基因在甘蔗中表达特性及其对甘蔗糖分积累影响的作用机理。【方法】以甘蔗品种桂糖28号(GT28)、拔地拉、新台糖20号(ROC20)、新台糖22号(ROC22)为供试材料,选取0叶、+1叶、幼嫩叶鞘、幼茎,通过半定量RT-PCR法对甘蔗SPSIII基因的表达进行分析。【结果】SPSIII在4个甘蔗基因型中的0叶、+1叶、幼嫩叶鞘和幼茎中均有表达,在GT284个不同部位的表达量较低,在拔地拉4个不同部位表达较均匀,在ROC204个部位中以嫩叶鞘的表达较高,在ROC22中以幼茎的表达较高。【结论】SPSIII在4个甘蔗基因型中的0叶和+1叶、幼嫩叶鞘和幼茎中均有表达,但SPSIII表达因甘蔗基因型不同而有所差异。

普通野生稻稻褐飞虱抗性在水稻改良中的利用研究

本文报道了普通野生稻稻褐飞虱抗源的杂交利用技术及其获得的一大批抗性创新种质和育种品系。研究了杂交后代性状分离、不同杂交方式、抗性鉴定时期和花药培养的抗性育种效果,证明了复交和回交方式、花药培养获得纯合体、以及早期(F2)抗性鉴定是在育种上利用的关键技术措施。本项目还配制了大量(293个)杂交组合,进行稻褐飞虱抗性创新品系的选育工作,对选育出的493个遗传稳定品系进行抗性鉴定、运用RAPD标记对筛选出的143份抗性育种品系进行分子标记多态性分析,从中首次获得了一大批(120份)具有DNA分子标记多态性(遗传多样性)的抗性创新种质,为今后培育抗性品种打下基础。研究还初步培育出5个具有生产应用价值的高产(或优质)抗稻褐飞虱育种品系和杂交稻组合。

科研单位大型仪器设备管理探讨

如何管理好大型仪器设备是当前大多数科研单位所面临的共性问题,仪器设备的管理水平直接影响到科研事业的发展。分析了新形势下科研单位大型仪器设备管理的现状及存在问题,从科研单位大型仪器设备的管理制度建设、管理人员的队伍建设、专人管理负责制、仪器设备共享、购置论证管理等方面,探讨了如何加强科研单位大型仪器设备的科学管理,以提高设备利用率,并提出了几点解决问题的对策和措施。

干旱胁迫对甘蔗根系碳氮代谢的影响

【目的】探究甘蔗根系响应水分变化的碳氮代谢生理应答机理,为后续研究甘蔗的抗旱性和高产栽培研究提供参考。【方法】以新台糖22号为试验材料,在大棚中采用桶栽方式,模拟自然干旱胁迫过程,在处理开始后第0、1、3、5、7、9、11、15、19和25 d采样并测定土壤水含量及甘蔗根系的水含量、碳水化合物和氮同化产物含量及关键酶活性,分析各项指标干旱胁迫后的动态变化趋势。【结果】干旱胁迫下,甘蔗根系水含量逐渐降低,至干旱胁迫第25 d时,根系水含量降至19.42%,较第0 d(75.64%)时降低56.22%(绝对值)。随着干旱胁迫时间的延长,氮代谢中脯氨酸和游离氨基酸含量随着干旱程度的加重而逐渐增加,于干旱处理第25 d时均达最高值,分别为85.69和20.08 mg/gFW,而硝酸还原酶活性变化呈前期降低、中期升高、后期又逐渐下降的波动变化趋势。碳代谢中的可溶性糖含量波动升高,干旱胁迫第19 d时达最高值(4.47 mg/gFW),干旱胁迫第25 d时出现回落;淀粉含量与可溶性糖含量变化趋势相反,干旱胁迫第25 d时淀粉含量降至最低值(0.55 mg/gFW),但淀粉酶活性逐渐升至最高值[18.15 mg/(gFW·min)]。【结论】干旱胁迫下甘蔗根系通过调节碳氮代谢关键酶活性、碳水化合物和氮同化物含量从而避免干旱对根系的伤害,保障甘蔗正常生长发育,但根系只能在一定时间范围内抵御干旱胁迫造成的伤害,因此需要在干旱初期阶段做好防范措施。

干旱胁迫下甘蔗苗期根系全长cDNA文库构建及EST序列分析

【目的】构建甘蔗根系全长cDNA文库,并进行测序,为分离克隆甘蔗抗旱候选基因奠定基础。【方法】在干旱胁迫条件下,以新台糖22号甘蔗根系为材料,采用SMART技术构建cDNA文库,并进行EST序列分析。【结果】文库构建质量鉴定结果显示,文库库容量为1.0×106PFU/mL,重组率约95%,文库插入片段长度在500～2000bp,平均长度约1102.1bp。挑选526个阳性克隆进行单向测序后,共获得523个ESTs序列,去除载体、接头序列以及长度低于100bp的序列后,进行聚类分析并组装,共得到468个Uni-ESTs,其中congtig29个,singlets439个,分别占总数的6.5%和93.5%。通过与NCBI非冗余蛋白库进行BLASTX比对,发现444个Uni-ESTs在GenBank有同源序列,占94.87%;获得24个未知蛋白功能基因,占5.13%。【结论】构建了干旱胁迫下甘蔗苗期根系全长cDNA文库,获得523个ESTs序列和468个Uni-ESTs,并获得一批新的未知蛋白功能基因。

甘蔗糖蜜发酵生产多不饱和脂肪酸的菌种筛选

利用苏丹黑B染色和测定多不饱和脂肪酸碘值的方法,从土壤中筛选出一株适合用甘蔗糖蜜为原料生产多不饱和脂肪酸的霉菌LB1。研究表明,该菌株培养的最适糖蜜浓度为10°BX,通过单因素实验和正交实验设计,确定了优化培养条件:最适温度28℃、摇床转速为160r/min、pH值为6.0和培养天数为5d。在优化条件下,菌株的油脂含量为其生物量的57.08%,其中油脂中多不饱和脂肪酸的组成及含量为:油酸15.42%,亚油酸14.38%、γ-亚麻酸23.55%、α-亚麻酸3.06%、花生四烯酸9.87%、廿碳五烯酸8.14%、廿二碳六烯酸6.07%等。多不饱和脂肪酸的含量占总脂肪酸的80.49%。对LB1菌株进行形态特征、生理特征分析及5.8S rDNA基因两侧的内转录间隙进行序列分析推测该菌株为反屈毛霉。

微生物絮凝剂在甘蔗糖厂中的应用研究

经过初筛、复筛,从活性污泥中分离出一株富产絮凝剂并适用于甘蔗蔗汁絮凝澄清的微生物菌株A。根据生化和生理特征及光学显微镜和电镜扫描的形态观察,初步鉴定该菌株为轮枝孢属(Verticilliumsp.)。同时对菌株进行培养条件的初步实验,获得该菌株产絮凝剂的最佳培养条件为:pH6.0,28℃,140r/min,培养4d。最佳碳氮源分别为葡萄糖和牛肉膏。微生物发酵液在蔗汁沉降试验中的絮凝率为69.2%,清汁色值IU为87.4。

籼稻与热带粳稻渗入系间的分子标记差异性和杂种优势分析

利用3个籼稻温敏核雄性不育系与9个热带粳稻基因渗入恢复系组配27个杂交稻组合,对杂种优势和产量构成主要因素与亲本间的SSR和SSR RAPD分子遗传距离的关系进行偏相关分析,筛选强优势杂交稻组合。研究结果表明,在籼稻与热带粳稻渗入系的杂种后代中,多数组合的每穗实粒数、总粒数和穗长呈现正竞争优势;杂种比对照的产量竞争优势主要是依靠每穗结实粒数的增加。在产量构成要素中,每穗实粒数与亲本间的SSR和SSR RAPD分子遗传距离显著相关,而有效穗数和千粒重与之不显著相关,表明在籼稻与热带粳稻渗入系间的杂交稻组合中可以通过增加亲本间的遗传距离增加杂种的每穗粒数,提高杂种的产量优势。通过分子标记辅助选择获得的"桂118S×T511"和"T1S×R138"两个杂交水稻组合示范产量分别比对照特优63增16 3%和6 7%,其亲本间的SSR遗传距离分别为0 83和0 71,亲本间分子多态性分别达到51 4%和42 8%,表明适当应用分子标记辅助选择有助于选育强优势杂交水稻组合。

茉莉种子发芽率及实生苗大田生长试验研究

通过研究种子鲜度、温度、光照等条件对茉莉种子发芽率的影响,并从实生苗植株树型、叶片、花器、经济性状等方面进行观察,结果表明:茉莉种子的新鲜度是影响其发芽的重要因素,刚脱离果肉的新鲜种子在适宜的条件下发芽率达到84%,而表皮干燥后种子的发芽能力迅速下降,剥离果肉的种子在常温条件下放置36 h后即丧失发芽能力:种子萌发的适宜温度为25—30℃;黑暗条件下可促进胚根生长。实生苗移栽田间生长正常,但在叶片形态、花大小、花瓣数多少等方面均有不同表现.这将为茉莉花品种的选育提供了更多的种质资源。

乙烯利调控甘蔗基因差异表达研究

【目的】建立并优化乙烯利调控甘蔗基因差异表达的cDNA-AFLP分析体系和银染体系,利用该技术对乙烯利处理的甘蔗进行基因差异表达研究,探讨乙烯利调控甘蔗生长的分子机理。【方法】以甘蔗品种ROC16为材料,在甘蔗生长40d左右时,叶面喷施200mg/L乙烯利溶液(对照为清水)0、3、6、12、24、48h后,分别取甘蔗叶片提取总RNA,建立cDNA-AFLP分析体系和银染体系;利用193对引物组合对乙烯利处理和对照的甘蔗叶片RNA混合池的样品进行差异表达分析,对部分差异转录片段进行回收、克隆、反向Northern杂交验证、序列分析和功能分析等。【结果】经cDNA-AFLP体系反应扩增,乙烯利处理和对照每个样品的扩增条带数均在35～80之间,处理和对照之间条带多态性明显。在反向Northern杂交验证分析中,24个测试样品中有11个无差异,假阳性率高达46%;在乙烯利作用下,甘蔗的CHI、GST、ARP、LHC、核结合蛋白基因以及一批未知基因差异表达,其中CHI、GST、LHC和核结合蛋白基因是与促进植物的抗病抗逆、提高光合作用等密切相关的因子。【结论】cDNA-AFLP技术是研究乙烯利诱导甘蔗相关基因差异表达和调控的一种较有效方法,具有可行性。乙烯利可能是通过调控甘蔗体内GST、CHI、ARP和LHC等基因的表达,从而表现出促进甘蔗生长、提高光合作用、增强抗病抗逆性等生理效应。

利用甘蔗尾叶生产蛋白饲料的研究

研究旨在以甘蔗尾叶和甘蔗糖蜜为原料,通过固态发酵法生产一种高蛋白饲料,并对接种量、固液比等发酵条件进行了初步优化。将甘蔗尾叶粉碎过筛后与稀释糖蜜按一定比例混合制成培养基,接入木霉与酵母,共同培养一段时候后测定培养物的粗蛋白质(CP)含量。通过试验确定了混合发酵最佳的工艺条件:最佳糖蜜锤度为28°Bx,最优固液比为1∶5,最适培养时间5 d,温度26℃,初始pH值为6.5、总接种量50%,菌种比例1∶1。其中固液比对粗蛋白质含量有显著性影响,在最优条件下的粗蛋白质含量为23.41%,较优化前提高了8.6%。