miRNA-122促进小鼠胚胎干细胞源性肝前体细胞的分化与成熟

目的:通过miRNA-122(miR-122)转染胚胎干细胞(ESCs)源性肝前体细胞,观察及评估其是否能推进ESCs向肝细胞的分化过程。方法:采用丁酸钠、成纤维细胞生长因子4(FGF-4)及地塞米松(Dex)联合序贯诱导小鼠ESCs使之初步分化为肝前体细胞,然后利用Gateway技术构建出pAV.Ex1d-CMV>miR122/IRES/eGFP重组腺病毒表达载体,使其转染贴壁诱导第9天的小鼠ESCs源性肝前体细胞,获得稳定高表达miR-122的细胞后继续培养。采用荧光显微镜观察转染后细胞形态的变化;使用real-time RT-PCR检测肝特异性基因的表达;免疫荧光检测肝特异性蛋白表达水平;吲哚氰绿摄取实验、糖原染色及尿素合成功能实验检测肝细胞功能。结果:丁酸钠、FGF-4及Dex联合序贯诱导可将小鼠ESCs成功地诱导为肝前体细胞。转染miR-122后,细胞在形态学上更接近成熟肝细胞;肝特异性基因白蛋白(ALB)、甲状腺素运载蛋白、α1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、细胞角蛋白8、胆固醇7α-羟化酶及细胞色素P450 3A4的mRNA表达均增高;肝特异性蛋白ALB及细胞角蛋白18均表达增高,而甲胎蛋白表达降低;吲哚氰绿摄取实验、糖原染色及尿素合成功能实验结果均显示转染miR-122后肝细胞功能较对照组明显增强。结论:丁酸钠、FGF-4及Dex联合序贯诱导可将小鼠ESCs成功地诱导为肝前体细胞;miR-122能够有效地促进小鼠肝前体细胞的分化与成熟。

项目反应理论的Parscale软件实现

项目反应理论（item response theory，IRT）也称条目反应理论，广泛用于教育学、心理学及医学量表测验中。Parscale软件是实现IRT理论的常用软件，由Eiji Muraki和DarrellBock等开发，现在由Scientific Soft-ware International（SSI）公司拥有（http：／／www．ssicentral．com／irt／）。

人肝脏特异性miR-122重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建microRNA-122(miR-122)的重组过表达慢病毒,并对其进行病毒包装、鉴定与滴度测定,为进一步研究miR-122的功能和作用机制奠定基础。方法利用PCR法扩增人类基因组DNA中miR-122发夹前体结构RNA,并将其克隆至PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro慢病毒表达载体上,经酶切及基因测序鉴定,将阳性重组PCDH-CMV-miR-122-EF1a-GFP-puro表达载体、p CMV-VSV-G和p CMVdR8.91三质粒共转染到HEK-293T细胞,收获上清液,将所得病毒悬液浓缩后梯度稀释后感染HEK-293T细胞,并利用绿色荧光蛋白进行病毒滴度测定。将重组慢病毒转染原代培养人皮肤成纤维细胞,并利用实时定量PCR检测miR-122的表达。结果重组慢病毒表达载体PCDH-CMV-miR-122-EF1a-GFP-puro酶切及测序鉴定证明载体构建成功,并得到滴度为3×108TU/m L的病毒液。病毒感染人皮肤成纤维细胞后miR-122表达明显增强。结论通过优化miRNA载体构建方法成功构建人miR-122的重组慢病毒载体并可在人类成纤维细胞内显著过表达miR-122,为miR-122的研究提供更高效稳定的基因载体。

人肝细胞核因子4α重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4 alpha,HNF4A)的过表达慢病毒载体,并对其进行病毒包装、鉴定与滴度测定,为进一步研究HNF4A的功能和作用机制奠定基础。方法利用PCR法扩增人类基因组DNA中HNF4A的cDNA序列,并将其克隆至PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro慢病毒表达载体上,经双酶切及测序鉴定,将阳性重组PCDHCMV-HNF4A-EF1a-GFP-puro表达载体、pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.91三质粒共转染到HEK-293T细胞,收集上清,将获得的病毒悬液浓缩后梯度稀释后感染HEK-293T细胞,并利用绿色荧光蛋白检测病毒滴度。将重组慢病毒感染原代培养人皮肤成纤维细胞HFFs,并利用荧光定量PCR检测HNF-4A的表达。结果重组慢病毒表达载体PCDH-CMV-HNF4A-EF1a-GFP-puro酶切及测序鉴定证明载体构建成功,并得到滴度为1×108 TU/mL的病毒液。病毒感染人皮肤成纤维细胞后HNF4A表达显著增强。结论通过优化载体构建方法成功构建人HNF4A的重组慢病毒载体并可在HFFs内显著过表达HNF4A,为HNF4A的研究提供更高效稳定的基因载体。

同伴教育模式对类风湿关节炎患者健康教育效果评价

目的探索同伴教育模式对类风湿关节炎(RA)患者的健康教育效果。方法应用随机数字表法,选取在滨州市某三甲医院出院的RA患者160例,分为对照组80例和干预组80例。对照组采用常规电话回访健康教育干预模式,干预组采用同伴教育模式,干预时间为3个月,比较干预前后两组患者生活质量(采用SF-36量表)、焦虑抑郁情况(采用SAS、SDS量表)、服药依从性(采用Morisky服药依从量表)。结果与对照组相比,干预后干预组患者的生活质量8个维度中在精力(VT)、社会功能(SF)、情绪职能(RE)、精神健康(MH)方面评分明显增高(P<0.05);与对照组相比,干预组患者的SAS、SDS评分明显增高(P<0.05);与对照组相比,出院3个月后,干预组患者服药依从性优于对照组(P<0.05)。结论同伴教育能有效改善RA患者焦虑抑郁情绪,促进患者积极配合,提高服药依从性,从而进一步提高患者生活质量。

湿性愈合理论在1例狼疮性肾炎合并重型多形红斑患者护理中的应用

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种以大量自身抗体形成/免疫复合物沉积、补体激活、炎症细胞浸润等引起多脏器损伤的自身免疫性疾病。SLE合并狼疮性肾炎的概率达50%左右,肾脏受累的程度会直接影响预后[1]。临床上诊断狼疮性肾炎主要是依据系统性红斑狼疮患者出现持续的蛋白尿、细胞管型、肾活检而确定。狼疮性肾炎根据病理分型可分为六型,分别是系膜轻微病变型、系膜增殖型、局灶增殖型、弥漫增殖型、膜型、硬化型[2]。重型多形红斑是严重的大疱性多形红斑、水肿性的红斑大疱、水疱累及全身各处,常伴严重的黏膜损害[3]。本科室于2019年10月20日收治了1例狼疮性肾炎合并重型多形红斑患者;该患者经过精心的治疗和护理团队运用湿性愈合理论护理39 d后,好转出院,现报道如下。

人FoxA1基因重组慢病毒载体的构建和鉴定

目的构建叉头盒蛋白A1（Forkhead-box A1,Fox A1）的重组慢病毒表达载体,为探究其功能和作用机制奠定基础。方法设计基因引物,采用聚合酶链反应（PCR）扩增出Fox A1的c DNA序列,然后将其克隆至PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro慢病毒表达载体上,经PCR、双酶切反应及DNA测序鉴定,将阳性重组Fox A1表达载体、p CMV-VSV-G和p CMV-d R8.91包装质粒共转染到HEK-293T细胞进行病毒包装收集病毒浓缩液,然后再感染293T细胞,通过观察绿色荧光蛋白来计算病毒滴度,最后用病毒转染原代培养人皮肤成纤维细胞（HFFs）,通过实时荧光定量PCR检测Fox A1 m RNA的表达水平。结果重组慢病毒表达载体Fox A1经PCR扩增、酶切及测序鉴定正确,并得到滴度为1×10~8 TU/m L的病毒液,病毒感染人皮肤成纤维细胞后表达显著增强。结论成功构建了人Fox A1重组慢病毒载体,并可在HFFs内高效表达,为后续Fox A1的功能和机理研究奠定了实验基础。

胶州湾水体悬浮物浓度遥感反演模式优化研究

为了及时、准确的了解胶州湾水域总悬浮物情况,采用2001—2015年水面实测数据,选取HJ-1、MERIS、LandsatTM/ETM+三个不同卫星数据,通过ENVI软件分析计算TM/ETM数据的多波段组合与总悬浮物浓度之间的相关关系,选取相关系数最大者分别构建多元函数回归模型,对胶州湾总悬浮物浓度进行了遥感定量反演研究。结果表明,估算因子三波段模型432算法与悬浮物浓度的相关性最好(R2>0.8),反演精度较高,以此建立了悬浮物浓度三波段半分析+生物光学遥感反演模型,检验值R^2均高于0.85,并通过F检验法和均方根误差(RMSE)分析,证明误差的敏感性差,该模型相关系数及稳定性好。因此,三波段模型在这三种反演模型中精度最好。

急诊留观肺部感染患者凝血功能与血栓弹力图检测的相关性

目的探讨急诊留观肺部感染患者常规凝血功能检查与血栓弹力图(TEG)的相关性。方法回顾性分析急诊留观病区123例肺部感染患者的TEG、凝血四项、血常规中的血小板计数(Plt)、D-二聚体和纤维蛋白降解产物(FDP)的结果,将TEG检测的各参数结果与凝血四项和Plt、FDP结果进行相关性分析。另外,采用ISTH的DIC评分系统进行积分,此积分分别与LY30和EPL进行相关性分析。结果(1)TEG检测的R时间与PT有一定的相关性(r=0.159,P=0.084),R时间与APTT显著相关(r=0.624,P=0.000)。TEG的K值与Fib呈显著相关(r=-0.367,P=0.000),K值与Plt呈显著相关(r=-0.425,P=0.000);TEG的α-Angle与Fib呈显著相关(r=0.411,P=0.000),α-Angle与Plt呈显著相关(r=0.479,P=0.000);TEG的MA值与Fib有一定的相关性(r=0.145,P=0.113),MA值与Plt有一定的相关性(r=0.078,P=0.393)。(2)D-二聚体与LY30,D-二聚体与EPL,FDP与LY30,FDP与EPL无相关性。(3)ISTH的DIC评分系统积分,分别与LY30和EPL均无相关性。结论肺部感染患者中,TEG技术与常规凝血四项在监测AECOPD患者凝血功能是存在相关性,但不能相互替代;TEG技术与D-二聚体、纤维蛋白降解产物指标在评估纤溶亢进方面无相关性。LY30和EPL对DIC的诊断尚不能提供依据。

探索适合中医药N-of-1试验的设计方案及模型

目前,中医药研究领域广泛开展单病例随机对照试验(N-of-1试验)。N-of-1试验要求研究的药物具有起效快、半衰期短的特点。由于中医药成分复杂,半衰期较长,难于满足上述要求;而且,基于伦理学的考虑,实际临床研究中一般不允许受试者存在洗脱期(不接受任何治疗)。由此提出了无洗脱期的N-of-1试验方案,并根据设计方案的特点,构建对应的混合效应模型。N-of-1试验的个体化治疗理念与中医辨证论治有相通之处,可以为中医药和循证医学的结合提供一个较好的桥梁。

系列N-of-1试验定量数据混合效应模型的模拟研究

目的对服从正态分布、有残留效应的系列N-of-1试验定量数据进行模拟研究,比较配对t检验、混合效应模型和贝叶斯混合效应模型三种方法的统计性能。方法 N-of-1试验设定为3个周期,每个周期患者随机接受两种处理。模拟研究的步骤包括:产生六元的N-of-1正态分布数据,随机分配处理和研究对象,增加残留效应,构建分析模型,评价模型和设置参数。模拟参数设定:样本量为3、5、8和10,不同时间的相关系数为0.0、0.5和0.8;两组设定不同比例的残留效应。使用第Ⅰ类错误、检验功效、平均误差(mean error,ME)和均方误差(mean square error,MSE)评价三种方法的优劣。结果当不存在残留效应(0%vs. 0%)时,三种方法均可控制Ⅰ类错误,三种方法的ME约为0;配对t检验有最高的检验功效和最小的MSE。当两组处理存在残留效应时,配对t检验的Ⅰ类错误随之升高,估计值偏离真实值(ME不为0),ME绝对值等于残留效应的一半。混合效应模型和贝叶斯混合效应模型能很好控制Ⅰ类错误(0.05),估计值接近真实值(ME约为0),而且两种方法的检验功效大致相等。结论不存在残留效应时(0%vs. 0%),配对t检验适合分析系列N-of-1数据;在存在残留效应时,贝叶斯混合效应模型和混合效应模型更适合用于分析系列N-of-1数据。

人肝细胞核因子4α联合组蛋白去乙酰化酶和甲基化转移酶抑制剂诱导成纤维细胞转分化为肝细胞的研究

目的 利用人肝细胞核因子4α（HNF4A）与表观遗传修饰[组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）＋甲基化转移酶抑制剂（DNMTi）]联合诱导人成纤维细胞向肝细胞转分化，建立更为高效、新型的肝细胞转分化方法。 方法取第6～8代人皮肤成纤维细胞，置于5’氮杂胞苷（5-AzaC）与丙戊酸（VPA）中，并感染HNF4A重组慢病毒共同诱导20 d。用倒置相差显微镜动态观察诱导过程中的细胞形态变化，实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测并分析肝细胞特异性基因的表达，吲哚菁绿摄取实验、糖原过碘酸-无色品红（PAS）染色和尿素合成功能实验验证生物学功能。 结果 诱导过程中，细胞形态逐渐由长梭形转变为上皮样形态，并逐渐开始过表达肝特异基因及表现生物学功能。诱导第20天，细胞在形态学上有明显肝细胞上皮样变化，胞质丰富、核大而圆深染且核仁明显；Real-time PCR检测肝特异性基因均有不同程度的表达上调，以白蛋白（ALB）及转铁蛋白（TF）最显著，分别为118%及250%，差异有统计学意义（t＝7.418、5.131，P＝0.002、0.001）；吲哚菁绿摄取实验结果显示约35%呈阳性细胞；70%细胞呈糖原PAS染色阳性；尿素合成动态检测可见诱导细胞尿素分泌量呈逐增多趋势，到达肝样细胞（iHEPs）期（第20天），每106个细胞合成的尿素氮量达到了等量正常肝细胞合成的55%，即iHEPs从生物学功能上均显示转分化肝样细胞肝功能部分接近正常肝细胞水平。结论 HNF4A与表观遗传修饰（HDACi＋DNMTi）可以联合诱导人成纤维细胞转分化为肝细胞样细胞，肝样细胞在基因表达及生物学功能部分接近正常肝脏细胞。