牛种布鲁氏菌A19ΔBtpA缺失株生物学特性及其免疫原性研究

布鲁氏菌四型分泌系统(T4SS)效应物BtpA是布鲁氏菌的重要免疫抑制分子之一。为了进一步了解BtpA对牛种布鲁氏菌生物学特性的影响,并探究BtpA基因缺失是否会影响布鲁氏菌的免疫原性。在牛种布鲁氏菌疫苗株(A19株)上对BtpA基因进行了缺失,通过qRT-PCR检测布鲁氏菌A19ΔBtpA缺失株中的BtpA mRNA表达水平,并探究布鲁氏菌A19株和A19ΔBtpA缺失株在生长曲线、胞内生存、黏附侵袭和体外应激方面的差异。此外,将A19株和A19ΔBtpA缺失株免疫小鼠,在免疫后的第7、14、21、28和35天使用间接ELISA检测小鼠体内的布鲁氏菌特异性抗体水平;通过ELISpot检测免疫第21天时小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ的表达水平,利用流式细胞术测定了小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ阳性CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞以及CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞的分类情况。结果表明:成功构建了A19ΔBtpA缺失株,A19ΔBtpA缺失株中BtpA的转录水平显著低于A19株,A19ΔBtpA缺失株与亲本株在生长曲线、胞内生存和黏附侵袭方面呈现相似的趋势。而体外应激试验显示,高渗应激条件下A19ΔBtpA缺失株的存活菌量明显低于A19株(P<0.05)。免疫原性研究中,与PBS组相比,A19组和A19ΔBtpA组均可极显著诱导小鼠产生布鲁氏菌特异性抗体(P<0.01);与A19组相比,A19ΔBtpA组淋巴细胞IFN-γ表达水平显著升高(P<0.05),使小鼠产生的IFN-γ阳性CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞以及CD4^(+)/CD8^(+)T细胞比值显著增高(P<0.05)。BtpA基因缺失不会影响布鲁氏菌A19体外胞内增殖,但可能参与布鲁氏菌抗高渗环境能力相关。此外,A19ΔBtpA缺失株比A19株更好地诱导Th1型免疫应答,诱导宿主产生与A19株相当的IgG特异性抗体,具有布鲁氏菌基因缺失疫苗的潜力。该研究将为进一步探究布鲁氏菌的致病机制和开发基因缺失株疫苗提供理论基础和数据支持。

布鲁氏菌外膜蛋白OMP10间接ELISA检测方法的建立及免疫原性评估

目的建立布鲁氏菌外膜蛋白OMP10间接ELISA检测方法,评价OMP10在小鼠体内的免疫效果。方法本研究表达和纯化了布鲁氏菌外膜蛋白OMP10,通过Western Blot进行验证,建立了OMP10间接ELISA检测方法,然后将OMP10与弗氏佐剂和LDH佐剂配伍成2种亚单位疫苗,免疫小鼠后检测抗体水平、脾脏淋巴细胞的增殖水平、CD4^(+)和CD8^(+)T细胞比值以及细胞因子分泌,最后通过攻毒试验评估OMP10的免疫保护效果。结果OMP10作为诊断抗原的特异性和符合率均高于70%;免疫小鼠后2种亚单位疫苗均能产生高滴度的IgG抗体,CD4^(+)/CD8^(+)T的比值均高于PBS对照组,IFN-γ高于PBS对照组,差异具有统计学意义(P<0.01),但IL-4未发生明显变化,表明OMP10能够诱导很好的体液免疫及Th1型免疫应答。免疫保护结果显示,2种亚单位疫苗免疫组小鼠脾脏指数和脾脏载菌量低于布鲁氏菌M5感染组,差异具有统计学意义(P<0.01),表明OMP10蛋白配伍的亚单位疫苗对布鲁氏菌M5感染小鼠具有高度的保护作用。结论外膜蛋白OMP10在布鲁氏菌诊断和疫苗方面具有一定的应用价值。

布鲁氏菌重组L7/L12蛋白对小鼠免疫保护效果的评价

为探究布鲁氏菌候选保护性抗原L7/L12的免疫原性及其对小鼠的免疫保护效果,本研究经PCR扩增羊种布鲁氏菌16M株L7/L12基因,构建重组质粒pET-22b-L7/L12,经双酶切鉴定正确后转化E.coli BL21(DE3)中,通过IPTG诱导表达并纯化后利用SDS-PAGE与western blot检测。结果显示,获得了16 ku的重组L7/L12蛋白(rL7/L12),且纯化效果较好。将rL7/L12以100μg/只腹腔注射免疫6周龄SPF BALB/c小鼠,14 d后以50μg/只加强免疫。首免后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d及49 d分别对所有小鼠尾静脉采血,通过间接ELISA方法检测小鼠血清中的IgG抗体、其亚型(IgG1、IgG2a)抗体水平及二者比值;并利用ELISA方法检测首免后21 d和35 d两组小鼠血清中细胞因子IL-2、IL-10和TNF-α的分泌水平。结果显示,首免后14 d,小鼠血清中IgG抗体水平迅速升高,于首免后21 d达峰值并持续至首免后49 d(P<0.01),对照组小鼠则一直无抗体产生;首免后14 d,rL7/L12组小鼠血清中的IgG1抗体水平极显著高于IgG2a抗体水平(P<0.01),且IgG1/IgG2a大于1;但首免后42 d,rL7/L12组小鼠血清中IgG2a抗体水平极显著高于IgG1(P<0.01),IgG2a/IgG1比值大于1。表明在免疫前期,rL7/L12主要诱导小鼠的Th2型体液免疫反应,免疫后期主要诱导小鼠Th1型细胞免疫反应。首免后21 d和35 d,rL7/L12组小鼠IL-2和TNF-α含量极显著高于PBS对照组(P<0.01),首免后35 d,该组小鼠抑炎因子IL-10的含量极显著低于PBS对照组(P<0.01)。首免后21 d和35 d,分别剖杀每组小鼠,分离小鼠脾淋巴细胞,利用ELISpot法检测各组小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ的分泌水平。结果显示,首免后21 d,rL7/L12组小鼠脾淋巴细胞IFN-γ的分泌水平有所升高,但与PBS对照组无显著差异(P>0.05);但免疫后35 d,rL7/L12组小鼠脾淋巴细胞IFN-γ分泌水平显著高于PBS对照组(P<0.05)。上述结果表明,rL7/L12免疫后期刺激小鼠机体产生Th1型细胞免疫反应,与抗体检测结果相符。首免后42 d通过腹腔注射途径以100μL(含1×10^(5)cfu/只)的羊种布鲁氏菌新疆流行株043攻击小鼠,攻毒后观察死亡情况,15 d后剖杀全部小鼠,通过检测其脾脏指数及脾脏载菌量(cfu)评价rL7/L12对小鼠的保护效果,结果显示,攻毒后15 d PBS对照组小鼠精神沉郁,但两组小鼠均无死亡;rL7/L12组小鼠的脾指数和脾脏载菌量均显著低于PBS对照组(P<0.05)。本研究结果首次表明,rL7/L12免疫小鼠后能够刺激小鼠的Th2型体液免疫反应和Th1型细胞免疫反应,且以Th1型细胞免疫反应为主。本研究为布鲁氏菌L7/L12亚单位疫苗的研发奠定了基础。

布鲁氏菌外膜囊泡生物信息学分析及免疫原性评价

【目的】探索布鲁氏菌外膜囊泡(OMVs)在亚单位疫苗上的应用前景,制备布鲁氏菌OMVs亚单位疫苗,评估布鲁氏菌OMVs的免疫原性。【方法】利用高速离心法制备羊种布鲁氏菌OMVs,通过透射电镜、SDS-PAGE和生物信息学分析对制备的OMVs进行形态和组分分析;使用纳米佐剂(LDH)和弗氏佐剂乳化OMVs后免疫小鼠,通过间接ELISA方法检测免疫后7、14、21、28和35 d小鼠血清中的特异性抗体,利用小鼠IgG ELISA检测试剂盒检测免疫后小鼠血清中IgG抗体水平,评估OMVs诱导产生的体液免疫水平;通过小鼠脾脏淋巴细胞分离与细胞因子白细胞介素4(IL-4)和γ-干扰素(IFN-γ)测定及小鼠外周血T淋巴细胞亚群的流式细胞术测定评估OMVs免疫小鼠的细胞免疫水平。【结果】成功提取并纯化了布鲁氏菌OMVs,其直径大小为20~160 nm。生物信息学分析结果显示,OMVs主要组成蛋白OMP25、OMP31、OMP16、OMP19、BP26及SOD均属于亲水性蛋白和抗原性蛋白,且存在多个B细胞和T细胞优势抗原表位。与PBS组相比,OMVs免疫小鼠后,不同佐剂组均可诱导小鼠产生高水平的特异性抗体和IgG抗体(P<0.01);同时OMVs可显著诱导小鼠脾脏淋巴细胞产生IFN-γ(P<0.05),并促进了CD4^(+)T细胞的表达(P<0.05)。【结论】本研究证实了羊种布鲁氏菌OMVs具有较强的免疫原性,能诱导小鼠产生强烈的体液免疫和细胞免疫反应,为布鲁氏菌新型亚单位疫苗的开发奠定了理论基础。

冠状病毒与宿主细胞受体相互作用的研究进展

冠状病毒(Coronavirus)是一类有囊膜的单股正链RNA病毒,具有复杂的进化历史,属于套式病毒目,冠状病毒科,冠状病毒亚科,冠状病毒属,这类病毒能广泛感染野生、家养禽类和哺乳动物^([1])。冠状病毒是目前已知的RNA病毒中基因组最大的病毒,成熟的冠状病毒直径为60~220 nm,分为4个不同的属:α、β、γ和δ冠状病毒(图1)。冠状病毒粒子多呈现球形或不规则形,其基因组大小介于26 000~32 000 bp,长度约为30 kb^([2]),包含6~11个开放阅读框(Open reading frame,ORF),第一个ORF占整个基因组约67%,编码16种非结构蛋白(Nonstructural protein)^([3]),其余的ORF编码辅助蛋白和结构蛋白。4种主要的结构蛋白为刺突表面糖蛋白(S)、包膜蛋白(E)、基质蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)^([4])(图2A、2B)。S蛋白在结合宿主细胞上的受体中起着至关重要的作用,也决定了病毒的宿主向性^([5,6])。冠状病毒可以通过S蛋白的突变或与其他毒株重组获得与新的宿主受体结合的能力,从而发生组织或宿主嗜性的改变。冠状病毒受体特异性的改变决定了病毒的进化方向和跨种间传播。冠状病毒因其跨越多种宿主物种屏障的灵活性而闻名,具有传播人兽共患疾病的能力。

牛种布鲁氏菌A19 VirB启动子缺失株的构建及其生物学特性研究

为探究VirB基因对牛种布鲁氏菌A19株毒力的影响,深入了解布鲁氏菌胞内存活的机制,本研究以牛种布鲁氏菌A19株为模板,利用VirB基因的上下游同源臂融合kana抗性基因构建自杀质粒。以瞬间电击的方式,将自杀质粒电转进菌体,利用同源重组将VirB启动子用kana基因替换,构建A19ΔVirB缺失株。通过实时荧光定量PCR检测缺失株VirB相关蛋白的转录水平,并对缺失株的生长曲线、体外应激、黏附侵袭及胞内生存进行分析。结果显示,试验成功构建A19ΔVirB缺失株。实时荧光定量PCR结果显示,缺失株VirB相关蛋白的表达量极显著低于A19株(P<0.01),其生长曲线虽然不同于亲本株,但生长趋势相同。体外应激结果显示,A19株和A19ΔVirB株热休克应激没有明显变化,但在强酸、强碱、高盐的刺激下,A19株的存活率显著高于A19ΔVirB株(P<0.05)。黏附侵袭结果显示,缺失株对巨噬细胞的黏附侵袭能力近似于亲本株。胞内生存结果显示,随着时间的延长,A19株的胞内存活趋势逐渐上升,而缺失株A19ΔVirB总体趋势逐渐下降并且与A19的差距越来越大。综上所述,本研究成功构建了VirB启动子缺失株,极显著降低了相关蛋白的表达,为后续相关缺失株的构建及布鲁氏菌毒力的研究奠定基础。

泛素相关修饰蛋白SUMO-2对RAW264.7细胞内布鲁氏菌16M存活的影响

为探究泛素相关修饰蛋白SUMO-2对布鲁氏菌16M的影响,本试验构建了SUMO-2基因干扰和过表达小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,并用布鲁氏菌16M进行侵染。参照GenBank中SUMO-2基因序列设计特异性干扰片段和过表达引物,克隆成功后连接至相应的慢病毒载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,选取阳性克隆菌提取质粒转染HEK-293FT细胞,将重组的慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,利用布鲁氏菌16M分别侵染构建成功的干扰和过表达细胞模型。通过实时荧光定量PCR检测SUMO-2 mRNA的转录水平,Western blotting检测SUMO-2蛋白的表达,ELISA检测IFN-γ和TNF-α水平,菌落计数来确定布鲁氏菌在细胞中的存活能力。结果显示,与对照组相比,干扰组SUMO-2 mRNA水平极显著降低(P<0.01),过表达组SUMO-2 mRNA水平极显著升高(P<0.01),成功构建了SUMO-2干扰和过表达细胞模型。Western blotting结果显示,布鲁氏菌16M感染能以时间依赖的方式下调SUMO-2蛋白的表达。经菌落计数后发现,SUMO-2过表达后布鲁氏菌的数量极显著减少(P<0.01),抑制布鲁氏菌16M的细胞内繁殖。而SUMO-2干扰后布鲁氏菌的数量显著或极显著增加(P<0.05;P<0.01),促进布鲁氏菌16M的细胞内繁殖。同时,经SUMO-2过表达后,IFN-γ和TNF-α水平极显著升高(P<0.01)。经SUMO-2干扰后,TNF-α水平显著降低(P<0.05),IFN-γ水平极显著降低(P<0.01),SUMO-2在RAW264.7细胞中的表达变化也影响IFN-γ和TNF-α的产生。综上所述,SUMO-2蛋白在布鲁氏菌胞内存活中起着重要作用,可能有助于阐明布鲁氏菌感染的致病机制。

布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统对树突状细胞自噬、胞内生存和炎症反应的影响

为探究Ⅳ型分泌系统在布鲁氏菌(Brucella)感染过程中的作用,深入了解布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统在疫苗开发中的潜力,本研究以牛种布鲁氏菌A19疫苗株为研究对象,使用A19 VirB启动子缺失株感染小鼠树突状细胞(DCs),通过菌落计数(CFU)评估Ⅳ型分泌系统对布鲁氏菌黏附侵袭及胞内生存的影响,同时对感染的细胞进行RNA和总蛋白的提取,分别通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测自噬基因Beclin-1的转录和表达情况;收集感染后的细胞上清液,利用ELISA检测炎症因子白细胞介素-6(IL-6)和IL-10的分泌水平。黏附侵袭结果显示,布鲁氏菌VirB启动子缺失株与亲本株A19的黏附侵袭水平无显著差异(P>0.05);胞内生存试验发现,感染的4 h,布鲁氏菌VirB启动子缺失株的胞内存活能力显著低于亲本株A19(P<0.05),感染后0、24和48 h极显著低于亲本株A19(P<0.01);实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示,感染后4、8和12 h,布鲁氏菌VirB启动子缺失株刺激细胞产生Beclin-1的水平极显著高于亲本株A19(P<0.01);ELISA结果显示,感染后8和12 h,布鲁氏菌VirB启动子缺失株刺激细胞产生IL-6的水平显著高于亲本株A19(P<0.05),而在感染后8和12 h,布鲁氏菌VirB启动子缺失株刺激细胞分泌IL-10的水平显著低于亲本株A19(P<0.05),感染24 h时极显著低于亲本株A19(P<0.01)。综上所述,当VirB启动子缺失后,布鲁氏菌对DCs的黏附侵袭能力并未明显改变,但显著降低了布鲁氏菌在DCs内的存活能力,提升了DCs的自噬水平,促进了DCs IL-6的分泌,抑制了IL-10的分泌。本研究初步探究了布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统在感染DCs过程中的生物学作用,为后续布鲁氏菌疫苗改造研究奠定了理论基础。

牛种布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统对巨噬细胞内质网应激和细胞凋亡的影响

旨在研究牛种布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统(T4SS)对巨噬细胞内质网应激和细胞凋亡的影响,深入探究布鲁氏菌的分子致病机制。本研究以牛种布鲁氏菌疫苗株A19及其T4SS启动子缺失株A19ΔVirB侵染小鼠巨噬细胞,分别在侵染的6、12、24 h收集细胞RNA和总蛋白,通过qRT-PCR以及Western blot检测内质网应激标志性分子(GRP78和CHOP)、凋亡相关分子(BAX和BCL-2)的转录水平和蛋白表达水平;通过流式细胞术检测不同时间点的细胞凋亡情况。结果显示,在侵染的6、12和24 h,缺失株A19ΔVirB组GRP78的转录水平及蛋白表达水平均显著低于亲本株A19组(P<0.05);在侵染后的6 h,缺失株组CHOP的转录水平及蛋白表达水平也显著低于亲本株(P<0.05),但到了24 h,出现了显著高于亲本株(P<0.05)的现象;在侵染的24 h,缺失株A19ΔVirB组BAX的转录水平及蛋白表达水平显著高于亲本株(P<0.05);而在侵染的24 h,缺失株组BCL-2的转录水平及蛋白表达水平显著低于亲本株(P<0.05);流式结果进一步显示,在侵染的24 h,缺失株组的细胞凋亡率显著高于亲本株(P<0.05);本试验的结果表明,T4SS缺失后,会导致牛种布鲁氏菌引起内质网应激的能力减弱,诱导细胞凋亡的能力增强。本研究为进一步解析布鲁氏菌的致病机制奠定了基础,也为今后布鲁氏菌T4SS的功能研究提供了科研依据。

新疆某地区3个牧场布鲁氏菌病流行状况调查及分析

为调查新疆某地区牛、羊布鲁氏菌感染情况,收集该地区3个牧场共3223份样本,其中牛血液样本1404份、羊血液样本1590份、牛流产胎儿样本66份、羊流产胎儿样本75份、牛生鲜乳样本65份及羊生鲜乳样本23份。血液样本经血清分离后进行虎红平板凝集试验(RBPT),流产胎儿样本的部分脏器及生鲜乳样经DNA提取后进行聚合酶链反应(PCR).将PCR结果为阳性的样本进一步进行PCR扩增及系统进化树分析。RBPT结果显示,3个牧场RBPT平均阳性率为牛6.8%,羊9.5%;其中牧场A阳性率为牛7.1%,羊9.1%;牧场B阳性率为牛11.7%,羊10.8%;牧场C阳性率为牛4.2%,羊9.1%。经PCR共鉴定出54份布鲁氏菌阳性样本,其中包括牛流产胎儿22份、羊流产胎儿30份、羊生鲜乳1份及牛生鲜乳1份,其余均为阴性。从上述PCR阳性样本中共鉴定出38份为羊种布鲁氏菌,其中包括牛流产胎儿16份、羊流产胎儿20份、牛生鲜乳1份及羊生鲜乳1份。系统进化树分析表明,鉴定出的羊种布鲁氏菌与内蒙古地区、挪威及印度等国分离的羊种布鲁氏菌生物3型菌株亲缘关系非常接近。综上所述,羊种布鲁氏菌是引起该地区牛、羊布鲁氏菌病的主要病原菌。研究结果为新疆地区控制和预防布鲁氏菌的感染提供了流行病学依据。

布鲁氏菌OMP10介导的小鼠骨髓源树突状细胞活化及其对小鼠T细胞增殖影响的研究

为探究布鲁氏菌外膜蛋白10(OMP10)介导小鼠骨髓源性树突状细胞(BMDC)的活化机制及其对小鼠T淋巴细胞增殖的影响。本研究通过体外分离培养BMDC细胞6 d后,将重组OMP10(rOMP10)与BMDC共孵育24 h,经流式细胞术分析BMDC表面共刺激分子(CD40、CD80、CD86)的表达情况,结果显示,与PBS组相比,rOMP10孵育BMDC能够诱导细胞表面共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达量显著升高(P<0.001)。同时采用ELISA检测共孵育后BMDC细胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-10、IL-4)的表达情况,结果显示,与PBS组相比,rOMP10孵育BMDC能够诱导其细胞因子(IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ)表达量极显著升高(P<0.01),但IL-4和IL-10的表达量极显著降低(P<0.001)。进一步采用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测共孵育后BMDC的Toll样受体(TLRs)和MHC-I、MHC-II类分子的mRNA转录水平,结果显示,与PBS组相比,rOMP10能够诱导BMDC的TLR2和TLR4(P<0.05),以及抗原递呈相关分子MHC-I和MHC-II的mRNA转录水平极显著升高(P<0.01)。另外,将小鼠脾脏T淋巴细胞与rOMP10预处理的BMDC共孵育后,经MTT试验检测T淋巴细胞增殖效率,结果显示,rOMP10处理组比PBS组T淋巴细胞的刺激指数增加2倍以上,且在树突状细胞和淋巴细胞比值(DCs:T)为1:50时,rOMP10处理组的T淋巴细胞增殖效率最高。综上所述,本研究首次证实布鲁氏菌OMP10能够诱导BMDC的活化,促进抗原递呈分子的转录,从而介导T淋巴细胞的高效增殖,该结果为解析布鲁氏菌感染与宿主免疫机制奠定实验基础,同时也为布鲁氏菌新型亚单位疫苗研发提供数据支持。

STAT6介导的巨噬细胞极化对布鲁氏菌胞内存活的影响

旨在探讨STAT6介导的巨噬细胞极化对布鲁氏菌胞内生存的影响。本研究采用布鲁氏菌光滑株S2308(S2308)和粗糙型疫苗株RB51(RB51)侵染巨噬细胞。利用qRT-PCR检测M1型巨噬细胞标志因子p65、NOS2和IL-1β,M2型巨噬细胞标志因子STAT6、ARG1、IL-10的mRNA表达水平;流式细胞术检测M1型标记分子CD86和M2型标记分子CD206的表达;Western blot检测p-STAT6蛋白及抑制剂AS对蛋白的抑制作用;ELISA检测M1型细胞因子TNF-α、IL-12和M2型细胞因子IL-4、IL-10的表达量;最后对胞内菌落进行CFU计数。qRT-PCR结果显示,在感染8、12 h时可显著诱导M1型因子mRNA转录表达,72 h时低表达,而M2型因子在72 h时高表达;流式细胞术结果显示,S2308感染12 h可显著诱导CD86的表达,感染72 h可显著诱导CD206的表达,但RB51对二者无影响;Western blot结果显示,S2308菌株在感染72 h时激活STAT6信号通路,而RB51几乎不激活该通路,抑制剂AS在2μmol·L^(-1)浓度时抑制效果最佳;ELISA结果显示,AS抑制剂可显著抑制IL-4、IL-10的释放,并促进TNF-α、IL-12的释放;CFU计数结果显示,S2308组的胞内菌呈先降低后显著上升趋势,加入AS抑制剂后可显著抑制布鲁氏菌胞内复制。布鲁氏菌S2308在感染后期能够通过STAT6诱导M1型巨噬细胞向M2型转化,并促进Th2型细胞因子的释放,从而有利于布鲁氏菌的胞内生存。而RB51几乎不激活该通路,不影响胞内生存。

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白的生物信息学分析及多表位筛选

本研究旨在对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3蛋白进行生物信息学分析及T细胞和B细胞表位的筛选。从GenBank数据库中找到NS3蛋白的氨基酸序列,用Expasy ProtParam在线服务器分析所得序列理化性质。使用TMHMM Server分析跨膜结构域,使用DNAStar软件预测NS3蛋白的二级结构,为了更准确地预测蛋白质的二级结构,使用SOPMA分析软件进行了二次预测。使用Phyre2在线服务器预测NS3蛋白的三级结构,并用Raswin软件标出各个元素所处的位置。使用4种预测软件(BCPREDS、ABCpred、BepiPred和SVMTriP)分析NS3蛋白的线性B细胞表位,使用NetMHCⅡpan预测CD4+T细胞表位,使用NetBoLApan和IEDB预测CD8+T细胞表位,将所得到的结果进行T细胞和B细胞表位筛选。结果表明,NS3蛋白质由683个氨基酸组成,分子质量为75 ku,理论等电点(pI)为8.31,化学式为C 3347 H 5346 N 916 O 1009 S 28,不稳定系数为35.93,平均亲水性(GRAVY)值为-0.267,表明NS3为稳定性亲水蛋白质。TMHMM结果显示,NS3蛋白不具有跨膜结构域。SOPMA结果表明,在NS3蛋白的二级结构中,α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲分别约占30.75%、22.55%、8.35%和38.35%,用DNAStar软件分别标出了α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲所处的位置。运用4种不同的B细胞预测软件筛选出8个线性表位:12-16、289-298、349-360、394-407、421-432、489-498、515-525和665-679位氨基酸。用NetMHCⅡpan筛选出4个T细胞表位:248-262、315-320、400-414和482-496位氨基酸。本研究为BVDV NS3蛋白优势抗原的筛选提供了理论依据。

布鲁氏菌Omp10对巨噬细胞极化及STAT6信号通路影响的研究

为探究布鲁氏菌(Brucella)外膜蛋白Omp10对小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMDM)极化及STAT6信号通路的影响,本研究将重组菌p ET30a-Omp10/DE3经终浓度0.1 mmol/L的IPTG诱导6 h后,获得主要以包涵体形式表达的重组蛋白Omp10(r Omp10)。同时,通过巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激BALB/c小鼠胫骨和腓骨细胞获得本实验用的梭型、圆形或卵圆形“煎蛋样”形态的BMDM细胞。将获得的r Omp10纯化后刺激BMDM细胞,收集刺激后不同时间点细胞,提取基因组后通过q RT-PCR检测M1型巨噬细胞标志因子NOS2、IL-12,及M2型巨噬细胞标志因子JAK1、STAT6、ARG1、IL-10 m RNA的转录水平,结果显示,相对于对照组,r Omp10刺激细胞4 h和12 h后,NOS2和IL-12 m RNA转录水平显著上调,刺激12 h时JAK1 m RNA转录水平显著下调(P<0.05),刺激4 h、12 h和48 h时STAT6 m RNA转录水平均显著下调(P<0.05),ARG1和IL-10 m RNA转录水平逐渐升高而后降低。通过流式细胞术检测BMDM中M1型标记分子CD86和M2型标记分子CD206的表达情况,结果显示,在r Omp10刺激下CD86表达量极显著高于对照组(P<0.01),且随时间延长其表达量呈下降趋势;CD206在刺激12 h时显著低于对照组(P<0.05),但72 h时显著高于对照组,且随时间延长其表达量呈上升趋势(P<0.01)。进一步通过ELISA方法检测刺激后不同时间的BMDM中细胞因子TNF-α和IL-10的表达量,结果显示,在r Omp10刺激BMDM 4 h、12 h、24 h时TNF-α表达量极显著高于对照组(P<0.01);而在r Omp10刺激BMDM 48 h时,IL-10的表达量显著高于对照组(P<0.05)。上述结果首次证实布鲁氏菌外膜蛋白Omp10抑制巨噬细胞中STAT6信号通路的激活,且在外膜蛋白Omp10刺激前期主要诱导巨噬细胞极化为M1型,在感染后期诱导M2型细胞因子的表达,本研究为阐明布鲁氏菌胞内存活机制提供新的研究方向和实验基础。

线粒体融合蛋白2基因干扰与过表达对布鲁氏菌诱导巨噬细胞凋亡的影响

【目的】试验旨在探究线粒体融合蛋白2(MFN2)基因干扰与过表达对布鲁氏菌诱导小鼠巨噬细胞凋亡的影响。【方法】利用RNA干扰技术设计3条特异性针对MFN2基因的siRNA序列(siMFN2-450、siMFN2-1661、siMFN2-2275)和1条阴性干扰序列(siMFN2-Negative);利用空质粒pcDNA3.1-EGFP通过过表达技术构建1个重组质粒pcDNA3.1-EGFP-MFN2。双酶切法鉴定过表达重组质粒pcDNA3.1-EGFP-MFN2,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测筛选最佳干扰序列并鉴定重组质粒的过表达效率,使用筛选出的最佳干扰序列和鉴定过表达后的重组质粒分别构建MFN2基因干扰及过表达的转染巨噬细胞模型;用牛种布鲁氏菌疫苗株A19侵染巨噬细胞,按照细菌数∶细胞个数=100∶1的比例侵染24 h,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)相关X蛋白(BAX)的表达情况,用流式细胞术检测细胞凋亡情况。【结果】双酶切结果显示,pcDNA3.1-EGFP-MFN2过表达重组质粒构建成功;实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示,siMFN2-1661组MFN2的表达极显著降低(P<0.01),pcDNA3.1-EGFP-MFN2组MFN2的表达极显著增加(P<0.01),成功构建干扰及过表达MFN2基因的转染巨噬细胞模型;布鲁氏菌侵染干扰MFN2基因表达的巨噬细胞后,BAX蛋白表达水平显著高于siMFN2-Negative组(P<0.05),BAX转录水平和细胞凋亡率极显著高于siMFN2-Negative组(P<0.01);布鲁氏菌侵染过表达MFN2基因的巨噬细胞后,BAX的转录及蛋白表达水平均显著低于pcDNA3.1-EGFP组(P<0.05),细胞凋亡率极显著低于pcDNA3.1-EGFP组(P<0.01)。【结论】本试验结果表明,干扰MFN2基因的表达会增强布鲁氏菌诱导细胞凋亡的能力,而过表达MFN2基因则会抑制布鲁氏菌诱导细胞凋亡的能力,结果可为研究MFN2基因的生物学功能提供参考,为进一步解析布鲁氏菌的致病机制提供理论基础。

牛病毒性腹泻病毒E^rns多表位蛋白的设计及验证

利用生物信息学方法分析牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E^rns蛋白,筛选出优势B淋巴细胞(简称B细胞)和T淋巴细胞(简称T细胞)表位组装成多表位蛋白,并在大肠埃希菌中进行表达和验证。首先从NCBI GenBank数据库获得E^rns蛋白的氨基酸序列,将所得到的序列进行理化性质、跨膜结构域、亚细胞定位、磷酸化、酰基化位点分析,预测二级结构及二硫键的位置,使用4种B细胞和2种T细胞软件预测其抗原表位,将预测的表位进行筛选并组装成多表位疫苗,进行密码子优化确保其在大肠埃希菌中高效表达,最后进行蛋白的纯化和Western blot验证。结果显示,E^rns蛋白由227个氨基酸残基组成,分子质量约为26 ku,理论等电点8.62,化学式为C1131H1768N326O335S14,不稳定系数为29.98,亲水性平均值(GRAVY)和脂肪指数分别-0.529和71.37,在大肠埃希菌体内半衰期大于10 h,不具有跨膜结构域,主要定位在细胞质中,有21个翻译后修饰(PTM)位点;在E^rns蛋白的二级结构中,α螺旋占约36.12%,β折叠占约18.06%,β转角占约7.93%,无规卷曲占约37.89%,而且具有4个二硫键。将筛选出的5个B细胞和6个T细胞优势表位用柔性linker组装成多表位疫苗,Western blot结果显示多表位蛋白对BVDV阳性血清具有良好的反应原性,为牛病毒性腹泻病毒E^rns多表位蛋白后续的研究奠定了基础。

布鲁氏菌T4SS 15个效应蛋白的生物信息学分析

目的 对布鲁氏菌T4SS 15个效应蛋白进行生物信息学分析。方法 从NCBI数据库中获取布鲁氏菌T4SS的15个效应蛋白的氨基酸序列,利用生物信息学软件分析15个效应蛋白的理化性质及同源建模分析跨膜区、信号肽、亲水性、保守结构域、B细胞抗原表位、T细胞抗原表位、抗原性、翻译后修饰位点及效应蛋白间的相互作用等。结果 15个布鲁氏菌T4SS效应蛋白主要为无信号肽和跨膜螺旋结构的亲水性蛋白,其中BspB有跨膜螺旋结构和信号肽、RicA、BspA、BPE005和BPE275疏水性蛋白;除VceC、BspB、BspC、BspE和BPE123外其余11个效应蛋白均具有1个或多个稳定结构域;BPE043有优势B细胞抗原表位且CD4 T细胞抗原表位数量较高;修饰化位点预测显示:15个效应蛋白中有12个同时具有糖基化、甲基化、磷酸化、乙酰化修饰位点;对效应蛋白互作预测分析显示BPE043可同时与VceC、BspE、BspF蛋白发生互作,其余11种效应蛋白间发生互作的概率较低。结论 BPE043蛋白抗原性较强,可作为布鲁氏菌潜在的疫苗候选基因,为布鲁氏菌T4SS效应蛋白生物学功能研究提供科学依据。

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白多表位疫苗筛选及生物信息学验证

为了筛选牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E2蛋白的多表位亚单位疫苗,本研究选用4种B细胞预测软件(immunomedicine group、ABCpred、BepiPred、SMVTriP)和2种T细胞预测软件(NetBoLApan、NetMHCIIpan)筛选出重叠肽作为优势表位,通过柔性linker连接成多表位疫苗,使用免疫信息学方法对抗原性、过敏源、理化性质、糖基化位点、二级和三级结构进行评估。通过二硫化物工程提高疫苗稳定性。使用分子对接评估疫苗构建体与免疫受体的结合能力,最后进行silico克隆。结果表明,成功构建17000相对分子质量的可溶性蛋白质,免疫信息学结果表明,疫苗构建体是非过敏性良好抗原,具有一个潜在的N-糖基化位点,在二级结构中α螺旋占约3.2%,β折叠占约43.2%,无规卷曲占约53.6%。三级结构Ramachandran作图发现优势区域中含有88.2%残基,进行细化后优势区域的残基增加到93.5%,3D模型表位作图也证明多表位疫苗具有良好的免疫原性,二硫化物工程确定出3对残留物可以形成二硫键,分子对接表明疫苗构建体与TLR3受体具有高亲和力,最后密码子优化和silico克隆确保设计的亚单位疫苗在大肠杆菌K12表达系统中更高表达。免疫信息学分析表明这种多表位疫苗可以有效表达并能够诱导强烈的T细胞和B细胞免疫应答。本研究为BVDV E2多表位疫苗的设计提供了一种新的方法。

牛IRF7蛋白对牛病毒性腹泻病毒增殖影响的研究

为了探索牛干扰素转录调节因子7(IRF7)基因对牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)增殖的影响,试验通过慢病毒包装和RNA干扰等试验构建IRF7基因的干扰和过表达细胞模型,然后运用实时荧光定量PCR扩增和Western-blot验证过表达及干扰效果,最后用BVDV进行感染,通过E2蛋白的表达水平评估IRF7基因与BVDV增殖的关系。结果表明:BVDV感染IRF7基因过表达细胞模型12 h后,E2基因相对表达量显著降低(P<0.05),且随着时间的延长,E2蛋白表达水平逐渐降低;而BVDV感染IRF7基因干扰细胞模型8 h后,E2基因相对表达量显著升高(P<0.05),E2蛋白的表达水平在8 h后逐渐升高,即过表达IRF7基因能够使BVDV增殖水平降低,而干扰IRF7基因的表达则能够使BVDV的增殖水平增加。说明牛IRF7蛋白对牛BVDV的增殖具有抑制作用。