葡萄VvERF655基因响应可可毛色二孢的表达模式及VvERF655与VvWRKY75的互作

可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae引起的葡萄溃疡病是葡萄上的主要枝干病害之一,对葡萄生产造成巨大影响。课题组前期研究发现葡萄VvWRKY75负调控葡萄溃疡病的发生,共表达网络分析表明,VvERF655基因与VvWRKY75共表达。为明确VvERF655是否参与葡萄对葡萄溃疡病的调控过程,本研究克隆了VvERF655,运用生物信息学对VvERF655的理化性质等进行分析,并通过RT-qPCR对VvERF655基因的表达模式进行分析,结果表明,VvERF655响应L.theobromae侵染并明显受脱落酸、水杨酸激素诱导。通过酵母双杂交技术分析发现,VvWRKY75与VvERF655在酵母中存在互作关系。以上结果表明,VvERF655可能参与寄主对可可毛色二孢的侵染以及激素调控过程。本研究为进一步揭示葡萄VvERF655基因的生物学功能奠定基础。

可可毛色二孢全基因组分泌蛋白的预测及分析

【目的】可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae)是一种世界性分布的重要植物病原真菌,可引起严重的葡萄溃疡病(Botryosphaeria dieback),影响果木品质并造成巨大的经济损失。本研究预测并分析可可毛色二孢基因组范围内的分泌蛋白,并明确其基本特征,为该病菌分泌蛋白致病机理的研究打下基础。【方法】依据已公布的可可毛色二孢全基因组序列,利用信号肽预测软件SignalP v5.0、跨膜结构分析软件TMHMM v2.0、细胞器定位分析软件ProtComp v9.0、GPI锚定预测软件big-PI Fungal Predictor和亚细胞器定位分析软件TargetP v2.0生物信息学软件对该菌中的典型分泌蛋白进行筛选。对分泌蛋白N端信号肽的长度、氨基酸使用频率及其切割位点进行统计分析。依据蛋白序列的同源性,应用BLASTP程序对分泌组蛋白进行功能注释分析,预测其生物学功能。采用蔗糖酶缺陷的酵母分泌系统,对所选分泌蛋白的信号肽进行活性检测。利用qRT-PCR方法检测所选分泌蛋白基因在可可毛色二孢侵染葡萄中的表达情况。【结果】在可可毛色二孢全基因组编码蛋白中共筛选获得552个潜在的具有典型信号肽的分泌蛋白,占全基因组预测蛋白总数的4.3%,其编码蛋白长度集中于101-400 aa。信号肽统计分析表明,其信号肽长度以18-20 aa的序列最为集中,信号肽长度为20 aa的蛋白数量最多。信号肽中使用频率最高的氨基酸为丙氨酸;非极性、疏水的氨基酸使用频率最高,占氨基酸总数的60.2%。其信号肽的-3至-1位置上的氨基酸相对保守,切割位点属于A-X-A类型,可被Sp I型信号肽酶识别并切割。336个分泌蛋白具有功能注释,其功能较多集中于细胞壁降解有关的酶类以及致病相关蛋白,并且这些蛋白在分子量、等电点、脂肪族氨基酸指数等方面均存在差异。通过蔗糖酶缺陷的酵母分泌系统证实,挑选的9个分泌蛋白信号肽均具有分泌活性。qRT-PCR检测结果表明,所选分泌蛋白基因在该病菌侵染初期的表达发生变化。【结论】利用生物信息学分析技术从可可毛色二孢全基因组中共预测获得552个经典分泌蛋白。其信号肽氨基酸长度分布广泛,氨基酸组成中非极性、疏水的氨基酸使用频率最高。功能注释主要集中在细胞壁组分降解相关的酶类、致病侵染相关的坏死诱导相关蛋白以及几丁质结合蛋白等。

葡萄霜霉病流行与预测研究进展

葡萄霜霉病是世界范围内危害葡萄最严重的病害之一,实际生产中,对该病害的防治以喷施化学药剂为主,由于用药时期和次数的不确定性,造成了农药残留、环境污染、食品安全等一系列问题。葡萄霜霉病的发生与流行和温度、相对湿度、降雨等环境气象因子密切相关,因此,基于葡萄霜霉病的发生与流行规律,对其进行准确的预测预报,指导田间病害的精准化防治,能够有效地减少化学农药不合理使用带来的问题。综述了葡萄霜霉病发生与流行的重要影响因素和预测预报模型的研究进展,以期为现有模型的整合利用和新型精准化预测预报模型的开发提供参考。

葡萄乙醛脱氢酶VvALDH10A9基因的克隆、表达及酶活性分析

由葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae真菌引起的葡萄溃疡病Botryosphaeria dieback是葡萄上的主要枝干病害,严重影响葡萄产量和品质。鉴定和分析参与葡萄与葡萄溃疡病菌互作的基因,有助于揭示和阐明葡萄抗溃疡病的信号通路。本研究根据葡萄溃疡病菌侵染后的葡萄转录组数据信息,利用逆转录聚合酶链式反应技术(RTPCR)克隆了一个受葡萄溃疡病菌诱导上调表达的乙醛脱氢酶基因VvALDH10A9(Vitis vinifera aldehyde dehydrogenase 10A9)。系统进化树分析表明,该基因编码的蛋白与拟南芥AtALDH10A8亲缘关系最近。利用实时荧光定量PCR分析VvALDH10A9的表达结果表明:VvALDH10A9的表达具有组织特异性,在茎、叶和花中表达量最高,在根中表达量相对较低;葡萄溃疡病菌侵染后,VvALDH10A9在葡萄抗病品种中表达变化不明显,而在葡萄感病品种中该基因显著上调表达。利用原核蛋白表达系统诱导合成的VvALDH10A9蛋白,经纯化后可降解乙醛,表明VvALDH10A9蛋白具有乙醛脱氢酶活性。

可可毛色二孢效应子LT_397基因的克隆及转录分析

可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae是引起葡萄溃疡病的主要致病菌之一。病原菌会分泌许多效应子抑制植物的防御反应。本试验对可可毛色二孢特有的效应子LT_397基因进行克隆,开放阅读框(open reading frame,ORF)全长1140 bp,含有11个半胱氨酸。生物信息学软件预测显示:效应子LT_397信号肽为位于N端的1~16个氨基酸。qRT-PCR结果表明:LT_397受可可毛色二孢诱导下,在侵染24 h的基因相对转录水平最高;在逆境胁迫处理方面:LT_397在营养、氧化、离子、酸碱和UV胁迫下基因的相对转录水平都上升。烟草瞬时表达表明,效应子LT_397可抑制水稻细菌性谷枯病菌Burkholderia glumae引发的过敏反应(hypersensitive response,HR)。以上结果为进一步分析效应子对寄主的致病机制奠定了基础。

我国葡萄白粉病菌对吡唑醚菌酯的敏感性分析

【目的】建立我国葡萄白粉病菌对QoI类杀菌剂吡唑醚菌酯的敏感基线,明确葡萄白粉病菌对吡唑醚菌酯的抗性水平。【方法】采用孢子萌发法测定了吡唑醚菌酯对来自我国北京、湖南、宁夏、云南、江苏5个葡萄种植地区的145株葡萄白粉病菌的EC_(50)值,并利用荧光定量PCR法检测cytb基因上G143A的突变情况。【结果】吡唑醚菌酯对43株当年未施用过化学杀菌剂的葡萄白粉病菌菌株EC_(50)值呈连续性单峰且符合正态分布,其均值(1.387±0.107)μg·mL^(-1)作为葡萄白粉病菌对吡唑醚菌酯的敏感基线。采用孢子萌发法分析的结果表明,供试菌株对吡唑醚菌酯的抗性频率为45.52%,采用荧光定量PCR(G143A)法分析的结果显示供试菌株对QoI类杀菌剂的抗性频率为57.69%。在RF>2时,采用荧光定量PCR检测结果与孢子萌发法测定结果趋势一致,Pearson相关性分析结果显示二者存在显著相关性。【结论】我国葡萄白粉病菌对吡唑醚菌酯的抗药性发生较为普遍,应注意与不同作用机制的药剂轮换使用或混用,以延缓抗药性发展。

葡萄VvSUC27基因的克隆及病原响应表达分析

由葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae真菌引起的葡萄溃疡病(Botryosphaeria dieback)是葡萄上的主要枝干病害之一,严重影响葡萄产业的健康发展。其中,致病力最强的为可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae。糖转运蛋白在调节植物对病原菌的免疫过程中起着至关重要的作用,关于葡萄中糖转运蛋白参与植物免疫机制的研究尚未见报道。本试验从‘无核白’葡萄叶片中克隆得到蔗糖转运蛋白VvSUC 27基因,其开放阅读框全长1515 bp,预测蛋白质分子量为54 kD,理论等电点(pI)为9.58。生物信息学预测该蛋白含有12个跨膜结构。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明:氨基环丙烷羧酸和脱落酸处理后VvSUC 27的表达水平持续上调;水杨酸和茉莉酸甲酯处理后,VvSUC 27的表达呈现上调表现但无规律的变化特征;激发子chitin和flg22处理后,VvSUC 27基因信号响应快速且明显;感病品种‘夏黑’接种可可毛色二孢后,VvSUC 27被迅速诱导,3 h时表达量达到最高,而后逐渐减弱。本研究将为今后阐明可可毛色二孢与葡萄互作的分子机制提供参考依据。

可可毛色二孢菌全基因组非经典分泌蛋白的预测及致病相关性分析

可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae)是一种世界性分布的重要植物病原真菌,可侵染500余种木本植物,危害严重。分泌蛋白在病原菌的侵入、扩展、定殖以及病害发生过程中发挥着重要作用,目前有关经典分泌蛋白的研究较多,而对于非经典分泌蛋白在植物病原真菌致病过程中的作用研究较少。本研究基于L.theobromae全基因组序列,通过生物信息学预测,得到238个候选非经典分泌蛋白编码基因。基因功能预测及富集分析结果显示,这些基因在碳硫裂解酶活性(Car-bon-sulfur lyase activity)通路中被富集。基于PHI-base病原-宿主互作数据库的注释信息,其中有15个非经典分泌蛋白编码基因可能参与了L.theobromae的致病过程。ApoplastP软件预测结果显示,其中4个定位于植物细胞质外体,11个定位于植物细胞内。经反转录荧光定量PCR(RT-qPCR)分析证实,这些候选关键非经典分泌蛋白编码基因的转录水平在葡萄枝条组织诱导条件下发生了显著的变化。根据本研究结果,非经典分泌蛋白在葡萄—L.theobromae互作体系中可能发挥着重要作用,这为深入解析非经典分泌蛋白对L.theobromae致病力影响的机制奠定了基础。

葡萄VvSUC12基因启动子的克隆及上游调控因子鉴定

枝干病害葡萄溃疡病近年来严重限制了葡萄产业发展。研究表明葡萄蔗糖转运蛋白参与寄主植物和病原菌的互作过程。为解析蔗糖转运蛋白VvSUC12在葡萄免疫反应过程中的功能,本研究克隆了VvSUC12基因翻译起始位点上游1 500 bp的启动子区,通过生物信息学分析发现该区域包含4个Dof转录因子结合序列(A/TAAAG)及多种激素调节与防御相关的顺式元件。实时荧光定量分析显示,接种可可毛色二孢菌显著诱导VvSUC12和VvDof19基因的表达。通过酵母单杂交实验筛选得到与VvSUC12启动子互作的转录因子VvDof19。酵母双杂交实验证实VvDof19具有自激活活性;进一步通过烟草瞬时表达发现Dof19-GFP的相对GUS活性约为对照GFP的9倍,表明转录因子VvDof19能够激活VvSUC12基因的表达。研究结果为深入研究蔗糖转运蛋白在葡萄免疫反应中的功能奠定基础。

北京市葡萄炭疽病病原菌的分子鉴定

葡萄是北京市重要的经济作物,葡萄炭疽病是栽培中的常见病害,造成减产10%-20%。近年来,常采用多基因系统发育分析结合形态学特征鉴定该病病原菌,日本（Suzaki,2011）、澳大利亚（Greer et al.,2011）等国家将其鉴定为胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides和（或）尖孢炭疽菌C.acutatum.

可可毛色二孢菌侵染后的烟草酵母双杂交cDNA文库构建

葡萄是世界上最重要的经济果树之一，据联合国粮食及农业组织统计，截止到2013年，中国葡萄栽培面积已达715．5万hm^2。葡萄总产量超2300万kg。长期以来，葡萄病害是影响葡萄产业健康发展的重要因素。近年来研究发现由葡萄座腔菌科真菌（Botryosphaeriaceae）引起的葡萄溃疡病（Botryosphaeria dieback）是葡萄上的主要枝干病害，病原菌主要通过自然孔口或修剪伤口侵入，感病植株出现枝干溃疡、树势减弱、果梗干枯、果实干缩或掉粒等症状，更严重的造成整个植株枯死。

可可毛色二孢β-1,4-葡聚糖内切酶LtEg1信号肽的鉴定及其酶活性分析

为明确可可毛色二孢β-1,4-葡聚糖内切酶LtEg1是否能够分泌至胞外及其活性,采用酵母互补试验分析了内切酶LtEg1的信号肽活性,利用3,5-二硝基水杨酸法检测了内切酶LtEg1活性,通过实时荧光定量PCR测定了LtEg1基因在不同侵染阶段的表达量。内切酶LtEg1的信号肽和酵母蔗糖酶的融合表达能够引起酵母蔗糖酶的外泌,使得酵母转化子能够在以棉子糖为唯一碳源的培养基上生长。内切酶LtEg1能够以羧甲基纤维素钠为底物,发挥其酶活功能。与营养菌丝阶段相比,LtEg1基因在病原菌侵染阶段的表达水平显著升高;且在接种后48 h,LtEg1基因的表达量达到高峰,约为营养菌丝阶段的12倍,表明内切酶LtEg1作为重要的外泌蛋白酶,在可可毛色二孢侵染致病过程发挥了重要作用。

可可毛色二孢菌效应子LtCre1与寄主葡萄候选蛋白的互作验证

可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae可引发葡萄溃疡病。效应子是病原菌分泌的可改变植物细胞结构和功能的蛋白分子,能促进病原菌侵染。目前,关于可可毛色二孢菌效应子与寄主葡萄的靶标筛选研究鲜有报道。Yan et al.(2018)证实可可毛色二孢菌效应子Lt Cre1是其致病的重要调控因子,并从葡萄c DNA文库中筛选获得25个候选片段可与该效应子发生互作。本研究拟对葡萄c DNA部分候选片段与效应子Lt Cre1进行互作验证,以期为解析可可毛色二孢菌与葡萄的互作机制提供参考。