融合蛋白ScFv(3G11)-mms13在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的构建抗Ⅳ型胶原酶单链抗体基因ScFv与磁小体膜蛋白基因mms13融合基因的原核表达载体pET30a(+)-ScFv-mms13,在大肠杆菌中诱导表达并对融合蛋白进行初步鉴定。方法 PCR扩增融合基因ScFv-mms13,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆入原核表达载pET30a(+)质粒,构建重组表达质粒。将重组质粒导入大肠杆菌DH5a中,利用PCR、酶切筛选鉴定重组菌株。用异丙基疏代半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,通过改变IPTG浓度、诱导时间优化表达条件。表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。结果重组质粒经PCR、酶切、测序证实重组质粒pET30a(+)-ScFv-mms13构建成功。SDS-PAGE电泳结果分析表明诱导菌株在43kDa左右处有明显异源蛋白表达,且确定了在IPTG终浓度为0.2mmol/L、诱导时间为6h时为表达稳定。对表达蛋白进行定位分析确定表达蛋白主要以包涵体形式存在,部分存在于可溶细胞质中。Western blot结果实证该表达产物可与His-tag抗体发生特异性结合,提示为目的融合蛋白。结论成功构建pET30a(+)-ScFvmms13表达载体并表达获得目的融合蛋白。

氧因素对趋磁螺菌AMB-1磁小体形成及其相关基因表达的影响

目的 观察氧因素对趋磁螺菌AMB-1生长量、磁小体形成及其相关基因表达的影响,为确定磁小体合成最适条件和研究磁小体形成机制提供实验依据.方法 在地磁有铁条件下,AMB-1经培养驯化接种,分别置于好氧和微好氧条件下培养.定时取样检测菌液OD600和Cmag值来研究细胞生长量和磁性增长量;用透射电镜观察16h菌样的磁小体形态;qRT-PCR检测磁小体相关基因mms13,magA和mms6的表达.结果 有铁微氧种子转至好氧条件培养12h后,其OD600值较对照组显著升高,2.5h后Cmag值明显降低,磁小体链短而疏松.16h菌样mms13,magA,mms6基因表达无明显差异.有铁好氧种子转至微氧条件培养14h后,其OD600值较对照组显著降低,10h后Cmag值显著增高,磁小体呈紧密的长链分布,16h菌样mms13基因表达量增加6倍,magA和mms6明显增高.结论 好氧条件有利于AMB-1细胞的生长,微氧条件促进磁小体的形成,并明显影响mms13,magA和mms6基因表达.

ScFv(3G11)-mms13融合基因克隆及表达载体构建

目的通过重叠延伸拼接PCR(SOE-PCR)技术克隆融合基因ScFv(3G11)-mms13并构建融合蛋白表达载体pET30a(+)-ScFv(3G11)-mms13,为重组制备肿瘤靶向细菌磁小体提供转基因载体。方法根据mms13基因和ScFv(3G11)基因的序列,设计以PCR引物,以克隆载体pMD18-mms13和pMD18-ScFv为模板,采用SOE-PCR技术构建融合基因ScFv-Linker-mms13。进而将融合基因ScFv-mms13与pET30a(+)连接构建重组表达载体pET30a(+)-ScFv-mms13,测序后应用软件DNAMAN进行分析。结果应用重叠延伸拼接PCR方法构建融合基因ScFv-linker-mms13(1158bp),然后通过克隆技术得到重组质粒pMD18-ScFvmms13。将融合基因ScFv-Linker-mms13插入到pET30a(+)构建了重组表达载体pET30a(+)-ScFv-mms13;菌落PCR、酶切、DNA测序鉴定结果均表明目的片段准确地插入到表达载体中。结论通过SOE-PCR技术扩增了预先设计的长达1158bp的融合基因片段ScFv-Linker-mms13,并成功构建了重组质粒pMD18-ScFv-mms13及重组表达载体pET30a(+)-ScFv-mms13,为磁小体用于肿瘤靶向治疗研究提供了实验材料。