蛋白质组氨酸磷酸化修饰的调节及功能作用

组氨酸磷酸化(pHis)在原核和真核生物的生命活动中发挥重要调控作用,并与包括恶性肿瘤在内的多种病理过程相关。pHis修饰中磷酰胺键在高温和低pH下容易断裂,其高度不稳定性导致对pHis修饰的鉴定和研究进展缓慢。近年来,磷酸化蛋白质组学新技术的发展以及pHis特异性抗体的出现,推动了p His修饰蛋白底物的鉴定和功能研究。首次在哺乳动物细胞中鉴定到超过700个pHis修饰蛋白,并陆续发现黏着斑激酶(FAK)和磷酸甘油酸变位酶1(PGAM1)等蛋白质的pHis修饰能促进肿瘤发展。本文主要探讨组氨酸激酶和组氨酸磷酸酶在调控特定蛋白质pHis修饰中的关键机制及其功能,以期为pHis修饰蛋白的生物学功能研究奠定基础。

微量样本泛素化蛋白质组学研究前处理方法优化

目的:对影响泛素化肽段富集的因素进行系统评估,以提升基于串联质谱的蛋白质组学方法检测微量样本泛素化修饰位点的能力,增加泛素化修饰鉴定覆盖度,进而为微量临床样本的泛素组学研究提供参考方法。方法:本研究中运用100μg HeLa全蛋白酶解肽段系统评估了在泛素化富集过程中不同抗体用量(9.375μg、15.625μg、31.25μg)、不同富集体积(300μL、600μL、1000μL)中鉴定泛素化肽段和位点的能力,以及对比冻干前加入二甲亚砜能否提升泛素化肽段鉴定能力。结果:不同富集条件对泛素化肽段的富集和鉴定效率有所不同。在不同的抗体输入量的评估中,使用15.625μg抗体珠能使富集效率达到57%且获得较理想的泛素化肽和位点鉴定量;在不同体积的对比中,使用600μL富集缓冲液能使单针检测出的泛素化肽段和位点超过10000且两次重复实验泛素化位点的定量相关系数达到0.95;冻干前加入二甲亚砜提高了疏水肽段的鉴定能力,使泛素化位点增加4.59%。结论:通过系统优化,对于100μg肽段的富集推荐使用15.625μg抗体量以及600μL富集体积,在样本冻干前加入二甲亚砜可以有效增加疏水性肽段的鉴定。

肝癌细胞中NME1功能研究及调控的pHis修饰底物发现

目的:研究核苷二磷酸激酶1(Nucleoside diphosphate kinase A,NME1)在肝癌细胞HCCLM3中的功能作用及其调控的组氨酸磷酸化(Histidine phosphorylation,pHis)修饰底物。方法:采用划痕愈合实验和Transwell小室实验以及蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析方法,对NME1敲除后细胞表型与分子水平变化进行分析。结果:在肝癌细胞中敲除组氨酸激酶NME1能降低细胞运动能力,全蛋白组差异分析发现NME1敲除后差异表达蛋白主要参与细胞底物黏附调控、细胞周期调节及蛋白激酶活性调控等生命活动过程。Western blot检测发现敲除NME1表达使细胞整体pHis修饰水平显著下调。随后使用整合pHis修饰位点鉴定策略,即通过双甲基标记、强阳离子交换色谱(Strong cation exchange,SCX)分离磷酸化修饰肽段与非修饰肽段、铜珠(Cu-iminodiacetic acid,Cu-IDA)富集组氨酸肽段以及质谱检测等过程,首次在肝癌细胞系中鉴定到242个pHis修饰位点及206个pHis修饰蛋白。大约25%的pHis修饰蛋白为首次发现,其中NME1敲低组pHis修饰水平显著下调的蛋白有(Cell adhesion molecule 3,CADM3)、(Cytochrome C,CYCS)、(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)及(Phosphofructokinase,PFKM)等近30个,表明NME1可能通过这些蛋白及代谢酶的组氨酸磷酸化修饰水平的变化影响肿瘤细胞间的黏附及代谢能力。结论:肿瘤细胞中NME1表达水平的变化会影响肿瘤细胞的运动能力,细胞内pHis修饰水平的失调可能全面参与疾病进程。

基于开放式搜索的有机磷化合物与人血清白蛋白加合物结构与位点鉴定方法研究

目的建立针对有机磷化合物(OP)新型加合物结构和位点的发现策略。方法采用串联测序结合开放式搜索的方式,对OP与人血清白蛋白(HSA)反应形成的加合物结构和修饰位点进行解析。结果建立了一种研究OP暴露后新型加合物结构及加合位点的新方法,利用开放式搜索策略发现半胱氨酸(C)为OP及其水解产物结合的新位点,可产生127.1370的质量增加,对应的二级质谱特征离子m/z为128.1439。结论所建立的OP⁃HSA新型加合物结构及加合位点发现通用研究策略,可用于发现OP加合新位点和新底物,有助于从分子水平提升对OP急性、慢性毒性作用机制的认识。