稳定表达叶酸受体α的C26细胞株的建立

目的建立稳定表达叶酸受体α(FRα)的C26细胞,用于FRα基因疫苗的后续研究。方法采用脂质体转染法,将前期构建的重组真核表达质粒pc DNA3.1-FRα基因导入C26细胞,用G418加压进行筛选,并通过单克隆操作,建立稳定转染叶酸受体α基因的单克隆细胞株。利用反转录PCR及免疫荧光细胞化学染色检测稳定转染细胞中叶酸受体α基因的表达情况,并利用反转录PCR检测传代细胞中FRα基因表达的稳定性。结果经转染、G418筛选以及单克隆化操作,得到单克隆FRα基因稳定转染细胞株,所得单克隆稳定转染细胞株可表达FRαmRNA及蛋白,并能够在多次传代后保持表达的稳定性。结论成功构建了FRα稳定转染细胞株。

有限积分变换法求解汽缸内气体的流动

本文提出利用有限积分变换法求解活塞式缸体内压缩室中气流速度场 ,以一汽缸为例进行了数值计算 ,结果表明这方法有较好的精度 。

叶酸受体α原核载体的构建及表达

PCR法扩增叶酸受体α基因片段,经NcoⅠ和EcoRⅠ双酶切后克隆到原核表达载体pet22b,并进行双酶切和测序鉴定;将测序正确的重组质粒通过Ca Cl2法转入BL21(DE3)表达菌株,IPTG诱导蛋白表达,镍柱亲和纯化,通过SDS-PAGE,Western blot和ELISA鉴定蛋白表达;免疫小鼠,血清效价检测蛋白免疫原性。经双酶切和测序验证,成功构建FRα-pet22b表达载体。Western blot验证表明,叶酸受体α基因能在BL21中表达目的蛋白,但ELISA值较低。经免疫后小鼠血清与市售叶酸受体α亲和力差,预示原核表达虽能得到叶酸受体α,但其构象可能与真核表达蛋白不同。

一种全人源IgG样抗EGFR/抗KDR双特异性抗体的构建与表达

为增强抗EGFR或抗VEGFR2(KDR)单克隆抗体的抗肿瘤作用,作者将抗人EGFR单克隆抗体(Cetuximab)可变区基因和抗人KDR单克隆抗体(m Ab-04)可变区基因融合并与人Ig G1的Fc段基因通过柔性肽连接在一起,得到全人源Ig G样抗EGFR/抗KDR双特异性抗体(Bi-Ab)的基因。将Bi-Ab基因插入载体p PICZα,转化毕赤酵母X-33并诱导表达。发酵液经硫酸铵沉淀法初步提取后采用Protein A亲和层析柱进一步分离纯化,得到电泳纯的Bi-Ab蛋白,其产量约为2.3 mg/L发酵液。表面等离子共振法(SPR)分析显示,Bi-Ab与EGFR或KDR的结合亲和力与其亲本Cetuximab或m Ab-04相近,表明该双特异性抗体Bi-Ab能与EGFR和KDR特异性结合,可用于进一步的抗肿瘤活性研究。

叶酸受体α真核表达载体的构建及在HEK293细胞中表达的鉴定

从高表达叶酸受体α的卵巢癌细胞株SKOV3中提取总RNA,RT-PCR扩增FRα基因片段,使用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,对其进行酶切及测序鉴定;用脂质体介导法将重组质粒转染入人胚肾细胞HEK293中,并利用RT-PCR、Western blot及细胞免疫荧光染色检测细胞内FRα基因的表达情况。通过RT-PCR扩增得到750 bp左右的FRα基因片段,并构建了真核表达重组质粒,经酶切、测序鉴定正确。转染HEK293细胞后,RT-PCR检测到细胞中FRαmRNA的存在,Western blot、细胞免疫荧光证明FRα蛋白在细胞中的表达。成功构建了FRα基因的真核表达重组质粒,该质粒可在真核细胞中表达FRα蛋白,这些实验结果为卵巢癌基因疫苗的研究奠定了基础。