原发性肝癌患者肝组织中乙型肝炎病毒X蛋白与P53蛋白的结合

癌抑制基因p53发生突变是导致肝癌发生的重要因素之一。突变的p53基因表达的p53蛋白稳定性提高易被检出。作者前已报道,免疫组织化学分析10例肝癌标本中HBx蛋白基因全部阳性,但p53蛋白仅有2例阳性。设想高度表达的HBx蛋白有可能在肝组织中与p53蛋白作用形成复合物。为了证实此设想,本文分别用抗HBx单克隆抗体和抗p53单克隆抗体作免疫沉淀和免疫印迹分析表明,在肝癌患者肝组织中HBx蛋白可与p53蛋白作用产生复合物,可能影响p53基因的抑癌功能。此为HBx蛋白在肝癌发病中起重要作用的一个方面。

原发性肝癌患者外周血中甲胎蛋白mRNA的意义

目的由于ＰＣＲ技术的应用，血循环中癌细胞的检测近有很大进展．本文用ＲＴＰＣＲ检测肝癌（ＨＣＣ）和其他慢性肝病患者外周血中ＡＦＰｍＲＮＡ，藉以反映ＨＣＣ细胞的存在，并与其他血清标记物比较．方法ＨＣＣ患者２２例，肝硬变和慢性乙型肝炎患者各１０例，健康成人受试者（对照）５例．取患者和对照的外周血，分离单核细胞，提取总ＲＮＡ并作电泳鉴定，用合成的两对引物进行巢式ＲＴＰＣＲ扩增ＡＦＰｍＲＮＡ，同时分析血清ＡＦＰ和乙肝标记物．结果ＡＦＰｍＲＮＡ在１３例ＨＣＣ（５９１％），２例肝硬变（２００％）患者外周血中测到，其余标本均为阴性．ＡＦＰｍＲＮＡ阳性的１３例患者肿瘤均大于５ｃｍ，为晚期患者．在该１３例患者中仅有６例（４６１％）在血清中测到ＡＦＰ，但有１２例（９２３％）ＨＢｓＡｇ，抗ＨＢｅ，抗ＨＢｃ全阳性，而ＡＦＰｍＲＮＡ阴性的５例该３标记物全阴性．结论ＲＴＰＣＲ扩增ＡＦＰｍＲＮＡ是检测ＨＣＣ和肝硬变患者循环肝癌细胞的敏感方法．患者外周血中的ＡＦＰｍＲＮＡ有可能作为肿瘤转移和复发的标记对ＨＣＣ诊断、随访观察和疗效评定有较大临床意义．

分子杂交化学发光法检测血清中乙型肝炎病毒DNA

目的 用非放射性的异羟基洋地黄毒甙 (地高辛 ,Dig)标记探针与靶DNA杂交 ,结合化学发光检测系统检测乙肝患者血清中HBVDNA。方法 应用宝灵曼公司生产的DigDNA标记检测试剂盒。将Dig标记的HBVDNA探针与点印迹在尼龙膜或硝酸纤维素膜上的靶DNA杂交 ,杂交后的膜与Dig AP抗体保温 ,然后用化学发光底物CSPD与之作用 ,导致在波长 4 77nm处发光 ,感光于X光底片上。结果 待检的 12 9份血清标本 ,用此法检测HBVDNA阳性率达 5 8 4 % ,敏感性 2 0pg～0 5 pg。为了比较 ,3 2 9份血清标本用显色法测定 ,阳性率 4 5 0 % ,敏感性 5 0 pg～ 1 0 pg。对照组呈阴性结果。 结论 Dig标记探针分子杂交化学发光法具有较高特异性、敏感性和简便等优点 ,可用于血清中HBVDNA的检测。

用DNA重组技术获得乙型肝炎病毒e抗原及其在临床检测中的应用

HBeAg和抗-HBe是乙型肝炎的经典标志物。HBeAg基因与HBcAg基因在DNA C区上相重叠。为要获得重组DNA衍生的HBeAg,本文从adw_2亚型HBV 3.2 kb全长DNA上切取带有HBc基因的BamHI-EcoRI片段,用Bal31和Hpa Ⅱ酶处理产生一系列长度不同的片段,与载体pUR222和pUC 18构成不同的重组质粒,转化到大肠杆菌。通过平板筛选、质粒酶切图谱和抗原抗体反应等筛到高效表达HBeAg的转化株YG301和YG302,中和试验证明了重组HBeAg的血清学特异性。用凝胶过滤、离子交换层析和亲和层析对其进行提纯并用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合Western印迹法进行纯度鉴定、含量分析和分子量测定。重组HBeAg制品具有高活性、稳定和安全等特点,实验证明它可以代替血源HBeAg制成酶联药盒用于乙肝诊断检测。

乙型肝炎病毒X基因的蛋白产物对HLA-DR表达的效应

目的 了解HBVX基因蛋白产物对HLA -DR表达的效应。方法 用野生型HBVX基因与真核载体质粒构建重组表达载体质粒pWHXⅡ转染HepG 2细胞。用PCR、Southern印迹、ELISA及Western印迹等分析鉴定目的基因DNA片段与其在转染细胞中的表达产物HBVX蛋白。将带重组质粒pWHXⅡ的HepG 2细胞的和带有HBV全基因组的 2 2 15细胞 ,在相同条件下用间接免疫荧光分析和免疫酶细胞化学技术检测。结果 在转染的HepG 2细胞和 2 2 15细胞表面均清晰地显示有HLA -DR表达 ,而对照组即不带质粒或只带载体质粒的HepG 2细胞则用同法不能在其表面检出HLA -DR的存在。结论 证明HBVX蛋白能在无炎症和外界因素存在下 ,单独诱导HLA -DR的表达 ,提示HBVX蛋白有参与乙肝免疫反应机制的可能性。

肝细胞癌p53基因的突变与表达

目的 :对HCC患者的肝组织和外周血单核细胞 (PBMC)进行突变 p5 3基因、p5 3蛋白和HBX的检测并作比较 ,以助评估它们与HCC发生的关系。方法 :从HCC患者肝组织和PBMC中提取DNA ,用PCR/SSCP和PCR/RFLP法分析 p5 3基因突变。HCC中HBx与p5 3蛋白表达用免疫组化法检测。 结果 :HCC标本 35 8% (5 /14)显示 p5 3基因第 7外显子突变发生在 2 49密码子。同样的PBMC标本中亦测到 p5 3基因第 7外显子有突变。免疫组化分析HCC肝组织中 p5 3蛋白检出率为 2 8 6 % ,而HBx在大多数标本中均有表达。 结论 :在HCC ,p5 3基因突变热点在第 7外显子 ,p5 3基因突变率与 p5 3蛋白检出率均约 30 %～ 40 % ,HBx较善遍地存在于所测的HCC标本中。这提示p5 3蛋白与HBx蛋白相互作用可能是HCC发病机制中的重要一步。

肝硬变患者TGF-β_1基因在外周血中表达及与PⅢP血清水平的关系

目的:为验证肝纤维化动物模型和慢性肝病患者肝组织中,转化生长因子(TGF-β1)的mRNA表达增强。作者分析肝硬变患者外周血TGF-β1mRNA和血清中有活性的TGF-β1蛋白及其结果与型前胶原N端肽(PP)血清水平间的关系。方法:肝硬变患者50例,健康自愿者8人,取其外周血,分离单核细胞(PBMC),提取总RNA,用巢式RT-PCR扩增TGF-β1mRNA并测定血清中TGF-β1和PP的水平。结果:分析表明患者外周血单核细胞(PBMC)中TGF-β1mRNA有高阳性率的表达。血清中TGF-β1与PP的水平均明显高于对照。结论:研究结果证实肝硬变患者TGF-β1基因在外周血中表达增强,与PP血清水平相关,表明TGF-β1可能在肝纤维化。

肺癌K-ras基因突变与呼吸道合胞病毒感染关系的研究

目的 探讨肺癌K ras基因突变与呼吸道合胞病毒 (RSV)感染的关系。方法 应用反转录聚合酶链反应 (RT PCR)结合单链构象多态性分析 (SSCP)免疫组化和ELISA方法检测肺癌组织中RSV、K ras基因和血清sIgM抗体。结果 ①RT PCR显示17.9% ( 7/3 9)的肺癌标本中存在有RSV基因序列。②RSVRT PCR阳性的肺癌组织冰冻切片免疫组化显示RSV抗原在细胞浆呈弥漫性着色。③不经反转录反应直接作PCR扩增 ,则RSV阳性的标本不能观察到RSV特异的电泳区带。④SSCP电泳示 2 5 .6% ( 10 /3 9)的肺癌组织标本中K ras基因的第 12位密码子有突变。⑤肺癌组织RSV基因的检出与K ras基因突变结果经配对计数资料McNemar检验分析 ,χ2 =0 .3 6,P >0 .0 5。结论 肺癌组织内有RSV感染 ,可能和K ras基因的突变有关。

转化生长因子-β1在肝细胞性肝癌中表达增强

目的转化生长因子－β１（ＴＧＦβ１）在细胞生长的负性调节上有重要作用，是肝细胞生长和增殖的强抑制物但肝癌（ＨＣＣ）患者肝组织中ＴＧＦβ１ｍＲＮＡ表达高．现检测ＨＣＣ患者外周血中ＴＧＦβ１ｍＲＮＡ表达，血清ＴＧＦβ１水平，以及肝组织中ＴＧＦβⅡ型受体（ＴＧＦβＲⅡ）的表达．方法ＨＣＣ患者外周血分离单个核细胞（ＰＢＭＣ），提取总ＲＮＡ，用反转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）技术扩增ＴＧＦβ１ｍＲＮＡ．血清ＴＧＦβ１水平测定用Ｐｒｏｍｅｇａ公司产的试剂盒．肝组织ＴＧＦβＲⅡ表达的分析用原位杂交法．结果ＨＣＣ患者２０例ＰＢＭＣＴＧＦβ１ｍＲＮＡ用ＲＴＰＣＲ检测阳性率达７０％，对照组阴性．ＨＣＣ患者４０例血清ＴＧＦβ１水平（２７５８ｍｇ／Ｌ±８１０ｍｇ／Ｌ）明显高于对照组（８２７ｍｇ／Ｌ±３７２ｍｇ／Ｌ）．原位杂交表明，ＴＧＦβＲⅡ在ＨＣＣ细胞的胞质中有弱表达．结论ＨＣＣ患者ＴＧＦβ１基因在转录水平和翻译水平上均显示表达增强．ＰＢＭＣ有可能代替肝组织用以检测ＴＧＦβ１ｍＲＮＡ的表达应用于基础与临床的研究．

有限稀释定量PCR检测血清HBV-DNA的临床应用及意义

探讨有限稀释定量PCR用于临床检测血清HBV -DNA ,及其对干扰素抗病毒治疗的指导意义。利用有限稀释定量PCR技术分别检测 38例HBsAg、HBeAg双阳性患者α - 2b干扰素治疗前后血清HBV -DNA含量 ,观察检测结果对治疗的指导意义。 38例患者干扰素治疗 12周HBV -DNA阴转 7例 ( 18 4% ) ;治疗 2 4周阴转 11例( 2 8 9% )。其中病毒滴度 >2 5 0pg/ml者阴转 11 1% ( 1/9) ;病毒滴度 2 5fg/2 5 0pg/ml者阴转 2 5 0 % ( 4/16 ) ;病毒滴度<2 5fgml者阴转 46 2 % ( 6 /13) ,三组比较P <0 0 1。有限稀释定量PCR检测HBV -DNA对慢性乙型肝炎患者干扰素治疗具有一定的指导意义 ,以病毒滴度≤ 2 5 0pg/ml,干扰素治疗 2 4周疗效较佳。

乙型肝炎与肝癌关系

乙型肝炎病毒(HBV)感染不仅能引起急性和慢性肝炎、肝硬变[1-4],而且由于持续HBV感染和宿主免疫反应,终可导致肝细胞癌(HCC)[5-27].过去对其机制不清,近年由于分子生物学、细胞生物学先进技术的应用,这方面研究取得重大进展[28-43],特别是HBV X基因的表达产物(HBx)与HCC的关系成为当前研究的热点,关于其机制现有多种观点提出,特别是HBx与抑癌基因p53作用的机制、HBx的基因突变对其功能的影响,以及HBx通过调节细胞信号传导途径激活转录的机制等,均在分子水平上进行了深入研究[44-83].据近期文献报道,除上述外HBx还有其他重要功能,如对于细胞增殖和细胞凋亡的作用及在不同条件下的不同效应.所以HBx被认为是一多功能的调节因子[78-87].台湾儿童广泛推行乙肝免疫,使HCC发病率明显下降的报道引起广泛重视,这提示免疫是预防肝癌的有效措施,也证明HBV感染与HCC发病的密切联系[88-97].

血清HBV-DNA定量PCR检测对干扰素治疗的指导意义

目的探讨有限稀释定量ＰＣＲ检测血清ＨＢＶ－ＤＮＡ对干扰素抗病毒治疗的指导意义。方法利用有限稀释定量ＰＣＲ技术分别检测 ３８例 ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ双阳性患者 α－２ｂ干扰素治疗前后血清 ＨＢＶ－ＤＮＡ含量。结果 ３８例患者干扰素治疗 １２周 ＨＢＶ－ＤＮＡ阴转７例（１８．４％）；治疗２４周阴转１１例（２８．９％）。其中病毒滴度＞２５０ｐｇ／ｍＬ者阴转１１．１％（１／９）；病毒滴度２５ｆｇ～２５０ｐｇ／ｍＬ者阴转２５．０％（４／１６）；病毒滴度＜２５ｆｇ／ｍＬ者阴转４６．２％（６／１３），三组比较Ｐ＜０．０１。结论有限稀释定量ＰＣＲ检测ＨＢＶ－ＤＮＡ对慢性乙型肝炎患者干扰素治疗具有一定的指导意义，以病毒滴度≤２５０ｐｇ／ｍＬ、干扰素治疗２４周疗效较佳。

HBV X基因在大肠杆菌中高效表达及血清抗X抗体检测

本文分别用大肠杆菌(E.colf)的Lpp启动子和M13噬菌体的geneⅡ启动子表达了分子量约为17 kDa的HBx蛋白,并以抗合成X多肽抗血清和抗X融合蛋白抗血清对该重组蛋白进行了分析鉴定(用ELISA法和Western印迹法),然后用重组X蛋白检测肝病病人血清中抗X抗体。我们采用一种改进的ELISA方法检测了212份血清标本,结果表明:肝硬化,慢活肝、肝癌、慢迁肝和急性乙型肝炎病人血清中抗X抗体阳性率分别为49.3%、47.6%、37.8%、29.6,6和40.0,6,高滴度的抗体主要存在于肝硬化和慢活肝病人血清中。

反转录-聚合酶链反应在呼吸道合胞病毒感染检测的应用

为呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）感染的临床诊断寻求敏感、特异的检测方法。采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增病毒培养液和急性呼吸道感染患者鼻咽分泌物中的ＲＳＶ基因，并应用地高辛标记ｃＤＮＡ探针对扩增产物进行鉴定。结果成功地提取了ＲＳＶｍＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ，经扩增得到４７１ｂｐ左右ｃＤＮＡ区带。流感病毒Ｂ、副流感病毒２型、腺病毒７型对照无扩增带。ＲＳＶ培养液１０倍连续稀释至１∶１０００，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增仍可见４７１ｂｐｃＤＮＡ区带。１３例患者鼻咽分泌物中的ＲＳＶ基因得到扩增，并经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹与斑点杂交证实。建立了ＲＳＶＲＴ－ＰＣＲ的方法，特异性、敏感性均较好，在临床标本的检测中将会有重要应用。

HBV核心蛋白结构与功能及其在基因治疗策略上的应用

核心蛋白对乙型肝炎病毒(HBV)复制过程起关键的作用。近年来对HBV核心蛋白(HBc)单体及其形成的核壳结构与功能有了深入的认识,HBc基因特定部位中插入外源基因后,其产物在细胞内仍能正确地折叠和自身装配,因而有可能在细胞内表达假HBc并掺人240个野生型HBc后,共同形成核壳结构,抑制其功能的发挥,干扰HBV复制。本文就HBc结构与功能区域的基础生物学及其在基因治疗策略上的应用进展作了综述。