宇佐美曲霉木聚糖酶的纯化和性质

采用缓冲液浸提、硫酸铵盐析、Phenyl-Sepharose CL-4B疏水层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析等分离纯化手段,从宇佐美曲霉E001固态发酵曲中分离出木聚糖酶组分,再经DE-AE-Sepharose fast flow阴离子交换层析进一步纯化,获得了两种电泳纯木聚糖酶XynⅠ和XynⅡ.分别采用SDS-PAGEG-75凝胶过滤层析测得XynⅠ、XynⅡ相对分子质量,两种酶均为单体蛋白质;等电聚焦电泳测得两种酶的等电点(pI);测定了XynⅠ、XynⅡ的酶动力学常数;序列测定XynⅡN末端15个氨基酸残基的.

果胶酶生产及其在苹果汁澄清中的应用

对黑曲霉(Aspergillus niger)LLW-1菌株固态发酵生产酸性果胶酶的发酵培养基组成和发酵条件以及利用果胶酶澄清苹果汁的工艺条件进行了研究。固态发酵产酶条件为:250 mL三角瓶装10 g基料(豆饼∶麸皮=2.0 g∶8.0 g),(NH4)2SO420 g/kg,Tween-80 1.5 g/kg,玉米浆50 mL/kg,KH2PO43.0 g/kg,CaCl21.0 g/kg,MgSO4.7H2O 1.0 g/kg(均相对于基料),料水比1∶1.2,自然pH;31℃静置培养72 h,期间在为24 h翻曲1次,果胶酶活力达2 418 IU/g(干曲)。酸性果胶酶澄清苹果汁的工艺条件为:果汁自然pH值,果胶酶用量500IU/L(果汁),明胶添加量0.05 g/L(果汁),酶解温度和时间分别为45℃和1 h。

木聚糖酶固态发酵培养基的优化

采用单因素试验和正交试验对宇佐美曲霉（Aspergillus usamii）YW-38菌株产木聚糖酶的固态发酵工艺条件进行了研究。结果表明，三角瓶优化培养基及发酵条件为：250mL三角瓶装8．0g基料（m（麸皮）;m（玉米芯）=3.5：4.5），NH4NO310g／kg，Tween-80 3g／kg，KH2PO43．0g／kg，CaCl21．0g／kg，MgSO4·7H2O1.0g／kg（均相对于基料），基料与自来水的质量比为1：1．3～1：1,4，pH自然；于29C培养72h，期间翻曲2次，此工艺条件下最高比酶活力为8752 IU／g。曲盘发酵工艺条件为：基料与自来水的质量比1：1．8，其余成分同三角瓶优化培养基，29℃培养68h，比酶活力可达8761IU／g。

圆弧青霉脂肪酶基因的克隆和表达

圆弧青霉PG37总RNA甲醛变性电泳呈现真核生物所特有的 2 8SrRNA和 18SrRNA条带 .根据PG37所产碱性脂肪酶 (LipPC)N末端氨基酸残基序列和真核生物mRNA在 3’端具有poly(A)等所提供的生物信息 ,采用RT PCR技术扩增了LipPC成熟肽和 3’非编码区的cDNA片段 ,并将该PCR产物直接克隆至pUCm T载体中 .序列分析表明 ,LipPC含有 2 5 8个氨基酸残基 ,其中保守的五肽序列为Gly His Ser Leu Gly .进一步采用ClonTech公司的SmartTM PCRcDNA文库构建试剂盒 ,扩增、克隆和测定了自转录起始点至编码区的cDNA片段 ,从而完成了LipPC完整cDNA的分析测定 .最后将编码完整脂肪酶蛋白质的cDNA克隆至 pGEX 5X 3表达载体中 ,SDS PAGE检测结果表明 ,大肠杆菌BL2 1所表达的GST LipPC融合蛋白质分子质量约为 5 3ku .

平板扩散法粗略确定碱性脂肪酶的活性

通过对圆弧青霉PG3 7所产碱性脂肪酶活性测定方法的研究和比较 ,建立了一种快速、直观、灵敏的固体琼脂平板脂肪酶活性测定方法 .利用脂肪酶在一定条件下分解三丁酸甘油酯所释放出的游离脂肪酸使指示剂 (维多利亚蓝 )变色的原理 ,根据变色圈直径的大小对酶活性进行粗略分析 ,特别适合于酶提纯过程中大批量样品酶活性的估测以及酶活性条带和其它蛋白质条带的区分 .

黑曲霉固态培养生产纤维素酶的研究

黑曲霉突变株ＤＭ－１是一株产纤维素酶菌株，其中β葡萄糖苷酶活性特别高。采用粗纤维原料固体培养，发酵９６小时（培养温度３１℃），其滤纸酶活和β葡萄糖苷酶活分别为９５和１２００ｍｇ葡萄糖／ｇＤＭｈ。本试验系统研究了各种营养成份和培养条件对ＤＭ－１菌株产纤维素酶的影响。最适发酵培养基为：稻草杆（或麦杆）∶麦麸为６０∶４０、硫酸铵３．０、硫酸镁０．３、玉米浆３．０，加水２００％，自然ｐＨ；环境湿度８５％－９０％。酶反应最适温度和ｐＨ分别为５５℃－６０℃和ｐＨ５．０。酶ｐＨ稳定性较好，在ｐＨ３．０－８．０范围内处理１小时，残余酶活力在８５％以上，该酶经５５℃处理３０ｍｉｎ，剩余酶活力为８６．０％。

饲用复合酶固体发酵工业化生产

宇佐美曲霉YW-38是一株高产饲用复合酶的生产菌株。在20m3自动固体发酵罐内32～35℃间断通风发酵64h,YW-38产酸性蛋白酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、β-甘露聚糖酶、果胶酶和淀粉酶等复合酶系,其中:酸性蛋白酶和木聚糖酶活力分别为15200和1200U/g。本试验研究了YW-38菌株的工业化生产的最佳培养基配方和发酵工艺条件。发酵培养基组成为:麸皮800kg,豆饼粉200kg,(NH4)2SO420kg,KH2PO45kg,水分55%～58%,pH值6.2～6.5,发酵过程中补加2次无菌水,每次200kg。

碱性脂肪酶同工酶的分离纯化

对经疏水层析 (PhenylSepharoseCL 4L)和阴离子交换层析 (DEAE FastFlow)等部分纯化的样品 ,采用制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步将其分离纯化 ,获得了PG3 7碱性脂肪酶的 3种同工酶LipaseⅠ、LipaseⅡ和LipaseⅢ .用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳和SephadexG 1 50凝胶色谱法分别测得同工酶的相对分子质量为 2 750 0和 2 90 0 0 .测定了LipaseⅠ的等电点为 5.4 ,动力学常数Km 和Vmax分别为 4 .54g/dL和 5.56μmol/ (min·μg) .

里氏木霉纤维素酶突变株选育的研究

以里氏木霉WXR－8为出发菌株，经紫外和亚硝基胍诱变处理后，得到一株抗纤维二糖阻遏突变株RM－27。突变株RM－27的纤维素滤纸酶活提高了64．5％。经过发酵条件优化后，采用固体发酵，RM－27菌株发酵144h（培养温度29℃），其滤纸酶活和β-葡萄糖苷酶活分别为600mg和115mg葡萄糖／gDMh。

脂肪酶基因结构和氨基酸序列的比较

采用PCGENE6 8软件系统对真菌脂肪酶基因和氨基酸序列进行了分析。真核生物中多数结构基因中含有内含子 ,但真菌脂肪酶基因几乎有一大半的是连续的 ;对于有内含子的基因 ,不同脂肪酶基因所含内含子数目各异。所有脂肪酶一级结构中都包含Gly X1 Ser X2 Gly保守序列 ,在真菌脂肪酶中该序列更保守 ;Ser、Asp/Glu和His3个氨基酸残基组成了真菌脂肪酶的活性中心 ;大多数真菌脂肪酶是糖蛋白 ,但也有一些不含糖基的脂肪酶 ,主要取决于脂肪酶一级结构中是否存在糖基化识别序列。

碱性脂肪酶的高效液相色谱和质谱分析

以常压层析系统纯化的碱性脂肪酶为出发蛋白 ,采用高效反相色谱对其进一步分离纯化 ,达到N末端氨基酸测序及肽谱分析所需的纯度 .用电喷雾质谱测得脂肪酶的相对分子质量为2 72 1 7± 1 .对该脂肪酶的胰蛋白酶水解条件及肽段的相对分子质量等进行了研究 .

绿色木霉WL 0422高产纤维素酶的研究

250 mL三角瓶装8．0 g基料(麸皮:稻草粉=4．0 g:4．0g),(NH4)3PO4 2．0％,KH2PO4 0．3％,CaCl2 0．1％, MgSO4·7H2O 0．1％,CMC-Na 3．0％(均相对于基料),料水比1:1．3-1．4,自然pH;于32℃培养108 h,期间翻曲2次,CMC酶活力2488 IU/g干曲。曲盘发酵的料水比改为1:1．6,其余组分同锥形瓶优化发酵培养基;于32℃培养96 h,期间翻曲2次,CMC酶活力可达2215 IU/g干曲。

里氏木霉固体发酵生产纤维素酶的研究

以里氏木霉突变株RM-27为纤维素酶生产菌，采用固体发酵法，29℃发酵144小时，其滤纸酶活和β-葡萄糖苷酶活分别为600mg和115mg葡萄糖／gDMh。并系统研究了各种营养成份和培养条件对RM-27菌株产纤维素酶的影响。最适发酵培养基为稻草杆或小麦杆70g、麸皮30g、硫酸铵3．0g、玉米浆2．0g，水200ml，自然pH。酶反应最适温度60－65℃，最适pH为5．0。酶pH稳定性较好，在pH3．0－7．0范围内处理3小时，残余酶活力在89％以上，该酶经50℃处理30min，剩余酶活力为85．6％。

黑曲霉纤维素酶的特性研究

在黑曲霉突变株DM-1所产纤维素酶中,β-葡萄糖苷酶活力较高。采用固体发酵培养,其滤纸酶活和β—葡萄糖苷酶活分别为95和1200mg葡萄糖/gDMh。本试验系统研究了该酶的固体发酵培养过程、最适反应温度、热稳定性、最适反应pH以及pH对酶稳定性的影响,为该酶在酿造行业中的广泛应用提供参考依据。

黑曲霉液体发酵纤维素酶的研究

在黑曲霉ＤＭ—１液体深层发酵所产纤维素酶系中，β－葡萄糖苷酶活性特别高。系统研究了ＤＭ—１菌株的摇瓶产酶条件及２５Ｌ发酵罐发酵工艺。２５Ｌ发酵罐试验结果表明，在通风量０．４～１．０ｖｖｍ、搅拌转速２５０～５００ｒ／ｍ、发酵温度３１℃及控制发酵液ｐＨ在４．０左右的条件下，发酵１０４小时，其β－葡萄糖苷酶活和ＣＭＣ分别为３３０和２４１ｍｇ葡萄糖／ｍｌ。发酵滤液经硫铵盐析沉淀、过滤或离心及干燥等过程得固体纤维素干酶粉。其中β－葡萄糖苷酶活为１３５００ｍｇ葡萄糖／ｇ，平均收率８０．２％。

扩展青霉脂肪酶的纯化及氨基酸序列测定

扩展青霉 (Pen .expansum)WMC2 0 718所产碱性脂肪酶经离心分离、硫酸铵沉淀、疏水层析、阴离子交换层析以及凝胶过滤等步骤 ,其酶纯化了 18.5倍 ,获得了比活性为 4 2 0 0U mg的纯碱性脂肪酶 ,提取得率 4 8.8%。纯化后的脂肪酶经过SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和高效反相色谱 (RP HPLC)检测 ,分别达到了SDS PAGE电泳纯和RP HPLC色谱纯。经SDS PAGE和SephadexG 15 0凝胶过滤色谱 ,分别测得酶的相对分子质量为 2 75 0 0和 2 82 0 0 ,表明该酶以单体形式存在。N末端 2 0个氨基酸残基序列测定的结果为ATADAAAFPDLHRAAKLSSA。该酶的最适作用温度为 30℃ ,在 35℃以下稳定 ,4 5℃处理 30min仅残留 30 %酶活性 ;pH稳定范围在 6 .5～ 10 .5之间 ,最适pH值为 10 .0。阴离子表面活性剂LAS对该酶活性的影响较大 ,而非离子表面活性剂AEO9对酶活性无影响。洗涤剂蛋白酶在规定的添加量范围内 ,对脂肪酶的活性影响较小。

产酸性果胶酶菌株的筛选及产酶条件的研究

从实验室保藏的9株黑曲霉菌株和1株宇佐美曲霉菌株中,通过初筛和复筛获得了一株高产酸性果胶酶菌株—宇佐美曲霉(Aspergillususamii)YL-1。YL-1菌株产酶发酵条件为:29℃静置培养72h,期间在24h翻曲1次。采用单因素试验确定了该菌株固态发酵优化培养基组成为:250mL锥形瓶装发酵基料10g(麸皮8g+豆饼粉2g),食用果胶0.9g,玉米浆0.5mL,吐温-800.15%,(NH4)2SO42.0%,KH2PO40.4%(均相对于基料),料水比1∶1,自然pH。酸性果胶酶活力最高达4831IU/g干曲。

里氏木霉液体发酵纤维素酶的研究

里氏木霉突变株RM-27是一株高产纤维素酶生产菌,本文对里氏木霉RM-27摇瓶发酵产酶条件及小型自动发酵罐工艺条件等进行了系统的研究。试验结果表明,在通风量0.2-0.6 vvm、搅拌转速为250—400 rpm、发酵温度29℃及控制发酵液pH在5.0—5.5的条件下,在25 L发酵罐上发酵104小时左右,其滤纸酶活和羧甲基纤维素酶活分别为31.8和516.0 mg葡萄糖/ml,发酵滤液用硫酸铵盐析沉淀得固体纤维素酶粉,平均滤纸酶活为2300 mg葡萄糖/g,平均收率为82.5％。

结合医学相关知识的生物化学教学法

生物化学是研究生命体内化学分子、化学反应和遗传信息传递的学科,是医学相关专业教学中重要的基础课程。生物化学课程的知识点繁多,概念较为抽象,代谢途径错综复杂,是教师最难讲解和学生最难掌握的课程之一。因此,教师必须在教学实践中不断探索生物化学的教学方法,运用结合医学相关知识的生物化学教学法并结合其他多种教学法,不仅增强了教学内容的生动性,而且激发了学生的学习兴趣,取得良好的教学和学习效果,为学生进入专业课程的学习打下了基础。

圆弧青霉PG37碱性脂肪酶的研究

圆弧青霉突变株PG37是一株高产碱性脂肪酸生产菌，摇瓶酶活为5052μ／ml，作者对PG37发酵产酶工艺及脂肪酶的酶学特性等进行了系统的研究．结果表明圆弧青霉PG37的摇瓶最适工艺条件为：装液量50ml／500ml三角瓶；摇瓶转速250rpm；培养温度及时间分别为28℃和96小时；起始pH7．5；发酶过程中第36、54和72小时各流加0．4％绵籽油．PG37脂肪酶的最适作用pH为10.0－10.5，最适反应温度为25℃，属低温碱性脂肪酶．