重组aFGF乳酸菌的构建、表达及其对小鼠溃疡性结肠炎的药效研究

采用分子克隆技术构建携带人酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factors,aFGF)基因序列的乳酸菌重组表达载体pGMN4,转化并筛选出高效表达aFGF的重组菌株,制成活菌制剂。口服5%葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液7d诱导小鼠溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC),在造模同时分别给予高、中、低剂量活菌制剂灌胃17d。通过比较小鼠的毛色、体重、便血、结肠长度、病变组织的髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性,以及观察结肠组织病理形态学变化,验证重组aFGF乳酸菌对DSS诱导的小鼠UC的预防和治疗效果。实验结果表明,重组aFGF乳酸菌的表达量可达50μg/mL,高剂量重组活菌制剂能够显著改善小鼠的一般情况和溃疡导致的结肠缩短,促进组织修复,保持结肠结构的完整性,并下调MPO的活性。重组aFGF乳酸菌对小鼠UC具有良好的预防和治疗效果,将为UC治疗制剂的开发提供更加广阔的思路。

穴蚁蛉幼虫全长均一化cDNA文库的构建

通过构建穴蚁蛉幼虫(俗称蚁狮)全长均一化cDNA文库,以期了解蚁狮的抗菌肽、毒素蛋白以及其它药用蛋白种类,为日后筛选、克隆表达和分离纯化这些药用蛋白奠定基础。用针刺诱导蚁狮产生抗菌物质后,分离纯化总RNA,结合SMART全长文库与DSN(duplex-specific nuclease)均一化技术,构建全长均一化cDNA文库,并通过平板计数和菌落PCR方法鉴定文库。随机挑选192个单克隆进行5′端测序,并与NCBI数据库进行比对分析。结果显示,构建出的文库平均插入片段长度为1 200 bp,原始文库的滴度达到7.5×105CFU/mL,而扩增文库则为1.95×1011CFU/mL。在所挑选的单克隆中,共获得190条有效序列,平均读长1 340 bp,文库重组率达到98.96%。与NCBI数据库比对后发现,这些序列可能是一些编码蚁狮免疫、消化及毒性蛋白的基因。

人外周血淋巴细胞培养基冻干工艺研究

目的对染色体分析用人外周血淋巴细胞培养基进行冻干工艺进行优化。方法首先以澄清度和细胞培养分裂相比例为检测指标确定冻干前培养液浓缩倍率。其次运用正交试验设计法L934法,以冻干粉外观、水分残留率、分裂相比例为检测指标,对冻干工艺过程的的预冻、升华干燥、解析干燥等三个阶段的主要参数进行考察和分析,获得主要参数最优组合的冻干曲线。最后,以优化的冻干工艺生产的三批冻干培养基进行适用性验证。结果确定冻干前培养液的浓缩倍率为3.0。正交实验分析表明:主干燥时间和主干燥真空压力对细胞分裂相比例的影响有显著的统计学意义(p<0.05)。优化的冻干参数为预冻温度-45℃、时间2 h;升华干燥阶段温度从-45℃升温至20℃,时间14 h,真空压力35 Pa;解析干燥阶段的温度维持于28℃,真空压力为1.0 Pa,终点测试压力无变化时通入干燥无菌空气至冻干箱内压力为76 kPa后压塞,再通入干燥无菌空气至箱体内压力为1个标准大气压时冻干结束。用优化冻干工艺生产的三批培养基的验证结果显示外观合格率、水分残留率、常温保存180 d后的分裂相比例均符合质量标准要求。结论优化的淋巴细胞培养基冻干工艺可行,可用于制备常温贮存的人外周血淋巴细胞培养基。

TAT-aFGF融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其生物活性测定

构建表达Tat与人酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor,aFGF)融合蛋白的重组质粒pET3c Tat-aFGF14-154和pET3c-Tat-aFGF27-154,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中。37℃,1mmol/L的IPTG诱导4h后,获得分子量约为18kDa的融合蛋白,表达量分别占菌体总蛋白的42%和24%。利用阳离子交换(CM-Sepharose FF)、肝素亲和层析(Heparin-Sepharose CL-6B)以及分子筛(Sephadex G-25)联用的方法可获得纯度大于95%的目的蛋白,得率分别为93ml/L和78mg/L。Tat-aFGF14-154及其对照蛋白aFGF14-154对Balb/c3T3细胞有明显促细胞增殖的作用,最佳作用浓度分别为1280ng/ml和160ng/ml。而Tat-aFGF27-154及其对照蛋白aFGF27-154则几乎没有促细胞增殖活性。免疫荧光分析结果表明,Tat-aFGF14-154及Tat-aFGF27-154均能穿过PC12、Balbc/3T3、HaCaT和海马神经元细胞的细胞膜,并主要定位于细胞浆中。此外,四种重组蛋白均能降低Aβ25-35对大鼠海马神经元细胞的毒性,在剂量为1000ng/ml时,Tat-aFGF14-154、Tat-aFGF27-154、aFGF14-154及aFGF27-154细胞存活率分别为90.66%、81.87%、85.71%和78.02%,而Aβ25-35模型组的存活率仅为56.87%。