鳞翅目核仁小RNA Sf-15在逆境胁迫下的表达分析

核仁小RNA(small nucleolar RNA,snoRNA)除了能够指导rRNA修饰外,在肿瘤发生及生物响应逆境胁迫中也发挥着重要作用。课题组在前期研究中发现一个家蚕C/D box snoRNA Bm-15在鳞翅目昆虫中高度保守,在草地贪夜蛾细胞Sf9中干涉此snoRNA同源序列Sf-15后,细胞出现凋亡现象,与逆境相关的基因表达变化显著。为了进一步研究该snoRNA的功能,对Sf9细胞施加非生物胁迫紫外线照射(ultraviolet,UV)和生物胁迫病毒感染,检测snoRNA Sf-15在胁迫条件下表达量的变化。结果发现,UV处理后Sf9细胞中snoRNA Sf-15迅速响应,处理后4 h表达即上调,至8 h达高峰,随后其表达量逐渐下降;而且随着UV剂量的增大,snoRNA Sf-15的诱导表达量逐渐升高。Sf9细胞被AcMNPV病毒感染后,snoRNA Sf-15呈现先下降后上升再下降的趋势,感染后48 h表达量最高,病毒感染组48 h后Sf-15表达量整体高于对照组。结果表明snoRNA Sf-15在细胞响应非生物及生物胁迫过程中均发挥着重要的作用。该研究在鳞翅目昆虫中发现snoRNA可以参与细胞的逆境胁迫反应,为探索昆虫snoRNA的功能提供了新的思路。

家蚕非编码RNA Bm-152功能初探

Bm-152是前期研究中发现的一个在家蚕丝腺中高表达的非编码RNA.采用实时荧光定量PCR技术对Bm-152在家蚕5龄到预蛹期不同发育天数丝腺中的表达谱进行检测.同时,在个体中过表达Bm-152,检测Bm-152可能参与的信号通路.结果显示,Bm-152在家蚕5龄幼虫丝腺发育过程中无明显的变化规律,但在吐丝第1天表达量较高,随后表达量又下降.通过在血淋巴中注射2μg piggyBac[A3-EGFP-A3-Bm-152]过表达载体,48h后发现Bm-152在丝腺组织中无明显过表达,但在非丝腺组织中可实现明显过表达,且表达量上调1.66倍;蜕皮激素信号通路基因Usp在非丝腺组织中上调1.95倍,E75A在非丝腺组织中上调2.26倍,保幼激素信号通路基因Met在非丝腺组织中上调1.79倍.表明非编码RNA Bm-152可能通过蜕皮激素和保幼激素信号通路参与家蚕发育,该结果为进一步探索Bm-152的功能提供了方向.

草地贪夜蛾Sf9细胞中snoRNA Bm-15反义寡核苷酸的定位及其对Bm-15的干涉效率

【目的】利用反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)干涉昆虫核仁小RNA(small nucleolar RNA,snoRNA)Bm-15的表达,并探索ASO进入细胞后的代谢途径。【方法】利用脂质体携带Cy5标记的、2'-O核糖甲基化修饰和硫代磷酸骨架修饰的Bm-15 ASO转染草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda Sf9细胞,然后通过Cy5标记与溶酶体及线粒体免疫荧光探针共定位研究Bm-15 ASO在细胞内的转运机制。利用实时荧光定量PCR检测转染Bm-15 ASO的Sf9细胞中Bm-15的表达量,分析ASO对snoRNA Bm-15的干涉效果。【结果】Bm-15 ASO转染草地贪夜蛾Sf9细胞48 h后,ASO荧光信号充斥整个细胞和位于细胞边缘的比例分别为34%和66%,说明ASO进入细胞后可能分布在不同的亚细胞器中;进一步对Bm-15 ASO和溶酶体及线粒体进行共定位发现,位于细胞边缘的ASO大多被运输至溶酶体而不会存在于线粒体等细胞器中。实时荧光定量PCR检测结果表明,转染Bm-15 ASO的Sf9细胞中Bm-15表达量下降了47%。【结论】即使经过多种化学修饰,ASO仍然逃避不了细胞内源降解机器的识别,这有效解释了某些情况下利用ASO干涉基因表达时靶标基因干涉效率较低的现象。