小果甜柿遗传转化体系建立及其抗冻性遗传改良的初步研究

【目的】建立小果甜柿(Diospyros kaki Thunb.‘Xiaoguo Tianshi’)叶片再生和优化其遗传转化体系,以期通过分子育种技术获得抗冻性强的砧木新种质。【方法】以小果甜柿叶盘为外植体,首先通过不同生长素(IAA)质量浓度和细胞分裂素(ZT,TDZ)配比探讨对其愈伤诱导和不定芽再生的影响;进而探讨其叶片对不同抗生素质量浓度组合的敏感性;此外,利用根癌农杆菌介导的叶盘稳定遗传转化体系,进一步探讨超表达君迁子(D.lotus L.)抗寒基因DlCBF1对小果甜柿叶盘再生植株抗冻性的影响。【结果】叶圆片在MS(1/2N)+ZT 2.0 mg·L^(-1)+TDZ 2.0 mg·L^(-1)培养基中愈伤形成率最高(64.71%);将愈伤组织接种到MS(1/2N)+ZT 2.0 mg·L^(-1)+IAA 0.1mg·L^(-1)生芽培养基中,不定芽再生率和不定芽数分别为31.11%和2.37个。头孢霉素质量浓度为400 mg·L^(-1)时可抑制农杆菌生长,且叶片愈伤形成率低(9.84%);卡那霉素对叶片再生影响大,在质量浓度为20 mg·L^(-1)时其愈伤诱导率为11.57%。小果甜柿叶片稳定超表达君迁子DlCBF1基因,获得再生植株73株,其中阳性植株5株,荧光定量结果分析,阳性植株#1和#47中DlCBF1基因表达量分别为野生型的13倍和11倍。经过-4℃低温处理8 h后,超表达株系与野生型株系相比,叶片受伤害程度更小,光合作用效率变化不明显,电导率低,H_(2)O_(2)和O_(2)^(-)在组织中的积累少,阳性株系表现出比野生型株系更强的抗冻性。【结论】在优化小果甜柿叶片外植体再生和稳定遗传转化体系的基础上,通过在小果甜柿叶片中超表达君迁子DlCBF1基因,获得6.85%转基因阳性再生植株,稳定超表达DlCBF1基因可显著增强小果甜柿再生植株的抗冻性。研究结果为培育抗冻性强的柿砧木新种质提供了科学依据。