水稻抽穗期基因OsDof6功能的初步研究

【目的】以前期通过穗发育芯片筛选到一个水稻Dof家族转录因子OsDof6为研究对象,进一步探究OsDof6的表达模式与生物学功能。【方法】对OsDof6的基因、蛋白及启动子序列进行生物信息学分析,利用CRISPR/Cas9技术对该基因进行定点编辑,通过实时定量PCR和亚细胞定位技术分析该基因的表达模式。【结果】对该基因的启动子序列分析表明,该基因启动子中存在大量与光响应、激素响应及胁迫响应相关的顺式调控元件。利用CRISPR/Cas9技术获得了2种不同突变类型的功能缺失突变体9522Dof6-3和9522Dof6-4。对突变体T1株系进行表型观察发现,相较于对照,两种突变体在营养生长阶段分蘖数明显降低,转入生殖生长阶段后,两种突变体的抽穗时间推迟约3 d。实时定量PCR结果显示OsDof6在水稻根、茎、叶和穗中均有不同程度的表达,在穗发育后期相对表达量明显提高;通过亚细胞定位分析发现OsDof6定位于细胞核。【结论】初步判断OsDof6基因会影响水稻分蘖数与抽穗期。

水稻糖苷水解酶基因OsINV3影响花粉育性的研究

花粉育性是水稻生殖发育中的重要性状,直接影响水稻的产量。本研究鉴定到一个包含Glyco_32核心结构域的糖苷水解酶编码基因OsINV3。通过实时定量PCR对OsINV3的时空表达模式分析发现,该基因在穗发育各阶段均有表达且在幼穗分化第6期具有较高的表达水平。通过亚细胞定位分析,发现OsINV3定位于细胞质。利用CRISPR/Cas9技术获得了粳稻9522和籼稻五山丝苗背景下的功能缺失突变体952201590-1和952201590-2、WSSM01590-1和WSSM01590-2。通过对表型分析及农艺性状统计发现,2种不同背景的突变体材料均表现为株高矮化、花粉育性下降、结实率降低。进一步分析发现,不同背景的突变材料,对育性下降的程度存在差异,在籼稻五山丝苗背景下,OsINV3的功能缺失导致花粉完全败育。通过半薄切片超显微观察发现,OsINV3的功能缺陷导致花药壁和小孢子发育异常。本研究为水稻花药发育提供新的研究思路,为水稻遗传育种提供遗传材料。

水稻的雌性不育研究进展

水稻雌性不育是由水稻雌性器官发育异常引起的不育。随着生物技术及功能基因组学的发展,对雌性不育的研究已从细胞学水平过渡到对分子机理的探索。科研工作者不断挖掘新的水稻雌性不育突变体,也定位和克隆到一些水稻雌配子发育相关基因。由于雌配子体发育过程的复杂性,导致水稻雌配子发育调控网络中的分子机理研究还有所欠缺。本研究通过水稻雌性不育的突变类型、雌性器官发育异常导致的基因突变,描述了水稻雌性不育的发生机理及雌性不育突变材料在机械化制种中的应用,为雌性不育的深入研究提供理论依据。

湘东丘陵4种林地深层土壤颗粒有机碳及其组分的分配特征

选取湘东丘陵区4种典型母质发育的林地土壤(花岗岩红壤、板岩红壤、第四纪红土红壤、酸性紫色土),分层次采集土壤剖面样品,采用物理分组方法,研究深层土壤颗粒有机碳(POC)及其组分(粗颗粒有机碳CPOC、细颗粒有机碳FPOC)的数量分布和分配比例,探讨POC及其组分与土壤有机碳、质地的关系。结果表明,4种土壤剖面POC储量介于2.63-11.59 t/hm2,以花岗岩红壤最高,其次为板岩红壤,第四纪红土红壤和酸性紫色土相对最低。4种土壤POC占SOC的比例(POC/SOC)介于1.5%-13.9%,花岗岩红壤POC/SOC随剖面加深而升高,板岩红壤和第四纪红土红壤则降低,紫色土POC/SOC在40-60 cm土层达到最大值后迅速降低。在40 cm以下的深层土壤中,花岗岩红壤和紫色土保存有数量可观、比例更高的POC。第四纪红土红壤POC储量相对较少、POC/SOC也在表土层较高。花岗岩红壤POC中以CPOC为主,而紫色土以FPOC为主,板岩红壤和第四纪红土红壤中CPOC和FPOC比例接近。所选4种土壤POC组分中,FPOC数量更能代表SOC数量的变化。SOC储量和质地是影响不同母质土壤POC及其组分分配差异的重要因素,在林地开发利用中也应重视深层土壤(>40 cm)中储藏的活性碳组分。

水稻穗发育相关基因酵母双杂交cDNA文库的构建

利用cDNA文库筛选与已知功能蛋白质互作蛋白质,是研究蛋白质之间相互作用的重要途径之一。本试验利用水稻武运粳7号（95-22）穗为材料,构建了一个穗发育相关基因酵母双杂交cDNA文库,试验表明,本实验构建的cDNA初级文库容量和目的文库容量分别为1.44×107 CFU/mL和9.6×106 CFU/mL,重组率均为95%;初级文库插入片段长度介于500～2 000 bp之间,目的文库插入片段长度介于1 000～2 000 bp之间,两者平均插入片段长度均在1 000 bp以上;通过NCBI数据库、RicexPro数据库和Rice Genome Annotiation Project数据库对目的文库中的19个单克隆测序分析得知,19个克隆测序序列匹配17个相应的基因,文库重复率为10.5%,其中16个基因均在穗部有表达。以上试验表明,本实验构建的cDNA文库是一个质量较高的文库,可以直接用于穗发育相关基因筛选。

水稻穗发育基因OsD1功能的初步分析

利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对一个水稻穗发育相关基因OsD1进行了定点编辑。通过定点编辑载体的构建、水稻愈伤组织的转化、转基因植株的鉴定及突变类型的分析,获得了4株OsD1功能缺失型突变体,其中2株属于纯合突变类型。表型分析发现,OsD1突变体的内外稃出现显著的畸形发育,花粉粒的淀粉充实度降低且颖花不结实,初步推断水稻OsD1基因可能参与花器官的建成和发育。

水稻B3转录因子OsL1的生信分析及表达模式

B3转录因子是植物特有的转录因子,与植物花形态建成、激素信号转导、种子生长发育及植物逆境胁迫响应密切相关。前期研究中,利用穗发育芯片筛选到一个OsL1基因。生物信息学分析发现,OsL1基因位于水稻4号染色体,基因全长4262 bp,编码433个氨基酸,蛋白分子量为48.7 kD,序列比对和系统发育分析表明OsL1属于B3家族转录因子,不含信号肽剪切位点和跨膜结构域,亚细胞定位于细胞核。启动子序列分析发现,该基因启动子中含有8个光响应元件及部分激素响应元件。实时PCR分析发现OsL1在水稻根、茎、叶、和穗中均有表达,其中在根和穗发育7期表达量较高,进一步克隆OsL1启动子区域,构建pCAMBIA1301-OsL1-GUS表达载体,遗传转化并鉴定获得转基因植株,The previous study在水稻根、茎、叶、和穗中均检测到了GUS信号,表明OsL1属于组成型表达。以上结果为深入研究OsL1基因在水稻生长发育过程的生物学功能提供了科学依据。

水稻YABBY家族的全基因组鉴定与表达分析

YABBY转录因子家族广泛参与植物的生长发育,但在单子叶植物的作用机理有待进一步研究。本研究利用生物信息学方法系统分析了水稻YABBY家族成员。保守性分析表明,水稻基因组中共有8个YABBY成员,不均匀地分布在2、3、7、10和12染色体上,成员之间相对保守,分为四个亚族。进化分析表明,片段复制或全基因组复制是YABBY基因在进化过程中的主要扩张方式,且YABBY家族的分化可能晚于单双子叶植物的分化。启动子和表达分析表明,水稻YABBY家族成员可能在水稻的花器官的发育、多中激素的响应中具有重要的作用。本研究为水稻YABBY基因的功能鉴定提供了理论支持和参考依据。

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点编辑水稻赤霉素2氧化酶基因OsGA2ox10

通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,以粳稻品种‘沈农265’为遗传背景对水稻赤霉素2氧化酶基因OsGA2ox10进行编辑,获得了该基因编码序列翻译提前终止纯合突变体ga2ox10-1、ga2ox10-2和ga2ox10-3。经RT-PCR检测突变体中OsGA2ox10基因表达量相比野生型极显著降低。表达模式分析显示该基因在根、茎、叶、叶鞘、幼穗中均有表达,其中在幼穗中表达量最高。亚细胞定位结果显示OsGA2ox10与GFP融合蛋白定位于细胞质中。本实验的开展为进一步明确GA2ox10基因功能和该基因在赤霉素代谢失活调控网络中的作用提供了依据。

水稻穗粒数相关基因研究进展

穗粒数作为影响水稻产量的主要因素之一,一直深受育种家的广泛关注。穗粒数形成受小穗分生组织分化率、小穗分化持续时间及穗型等多因素控制,是个十分复杂的生物学过程。随着植物功能基因组学研究技术的飞速发展,目前水稻穗粒数基因克隆及机理研究等方面已取得了一些进展。本研究从穗分生组织发育、穗型等方面阐述了调控水稻穗粒数发育基因的研究进展,探讨了当前水稻穗粒数研究所存在的问题和未来的研究方向,以期待为水稻高产育种提供理论依据。

水稻OsZ314基因克隆及转录激活验证

穗是水稻(Oryza sativa L.)重要的生殖器官,其生长发育直接影响水稻的产量和品质。前期研究中,我们对水稻生殖生长时期穗发育各阶段的转录组、蛋白组数据进行联合分析,筛选到一个MYB基因家族的转录因子OsZ314基因。生物学信息分析表明,该基因位于1号染色体上,拥有典型的R2R3-MYB型转录因子结构域,且在水稻幼穗时期表达量最高;亚细胞定位结果显示,OsZ314基因定位于细胞核中;转录激活试验表明,OsZ314基因具有转录激活功能。本研究为深入探索OsZ314基因在水稻穗发育时期的分子生物学功能奠定了良好的基础。

CRISPR/Cas9定点编辑水稻穗发育Osa1基因

CRISPR/Cas9是一种快速发展的基因组定点编辑技术。利用该技术对水稻穗发育基因Osa1进行定点编辑,精准敲除Osa1基因,获得Osa1功能缺失突变体,为Osa1基因功能的深入研究提供了准确可靠的突变体材料。

基于CRISPR/Cas9研究叶形相关基因NRL2对水稻抗旱性的影响

为了研究水稻叶形相关基因NRL2的功能,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以超级稻品种中嘉早17 (YK17)为背景,对调控水稻叶形相关基因NRL2进行定点编辑,并通过农杆菌介导的方法将其转化到籼稻品种中嘉早17中。通过对34个转基因T0代植株进行测序,结果显示34个转基因植株中有7个纯合突变株系,6株无突变,其余均为杂合突变。其主要分为3种突变方式,分别为T,C,A单核苷酸插入。通过对基因突变后NRL2编码的蛋白序列进行分析发现这3种突变均导致氨基酸序列移码。在VK005-4-1突变体株系中,NRL2的RNA水平极显著下调。干旱处理结果显示,突变体耐旱能力弱于背景亲本中嘉早17,且与耐旱相关基因在突变体中表达量显著低于背景亲本。总之,本研究利用CRISPR/Cas9技术敲除水稻叶形相关基因NRL2,得到的基因敲除株系,其耐旱性显著低于背景亲本中嘉早17,为进一步研究NRL2影响植物耐旱性提供技术支撑。

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得水稻GRAS家族转录因子G540突变体

GRAS转录因子是植物特有转录因子,一般由保守的GRAS结构域组成,与光信号转导、赤霉素信号转导、植物生长发育及植物逆境胁迫响应密切相关。水稻GRAS转录因子G540中含有2个RPT1结构域和2个GRAS结构域,系统进化分析和表达模式分析发现,G540属于GRAS转录因子家族中的HAM亚家族,在水稻穗早期发育阶段特异表达,推断G540可能参与穗的早期分化或形态建成。本研究利用CRISPR/Cas9技术对G540进行定点编辑,构建G540基因敲除载体并利用农杆菌介导转化水稻粳稻品种‘9522’,鉴定并获得遗传转化植株。对转化植株的靶序列进行分析发现,9522G540-1在靶序列上缺失了第4位C碱基,9522G540-4在靶序列的第3位和第4位之间插入了一个A碱基,9522G540-2在G540的双等位基因上出现了不同的突变,一条链在靶序列上缺失了第4位C碱基,另一条链在靶序列上缺失8个碱基。对G540突变后的氨基酸序列分析发现,9522G540-1、9522G540-2和9522G540-4的RPT1和GRAS结构域完全缺失,即成功获得以‘9522’为背景的G540功能缺陷型突变体。为进一步探究该基因在穗发育进程中的生物学功能和分子机制提供遗传材料。

OsYABBY4基因调控水稻株高的功能研究

株高是影响水稻产量、光合速率、抗倒性的重要农艺性状,赤霉素对株高形成具有重要调控作用。YABBY家族基因作为植物特有的转录因子,参与GA信号途径,调控水稻株高。通过CRISPR/Cas9技术定向突变了OsYABBY4基因,成功创制了3种不同突变类型的osyabby4突变体。表型分析发现,osyabby4突变体结实率下降,倒1和倒2节间的伸长受到抑制,导致株高显著降低。α-淀粉酶诱导及赤霉素相关基因差异表达实验表明,OsYABBY4通过参与GA信号转导调控水稻的株高。本研究为水稻理想株型育种提供了新材料,同时进一步完善了水稻株高分子调控网络。