小鼠miR-122重组慢病毒载体的构建和鉴定

目的构建携带miR-122的重组慢病毒表达载体,为研究miR-122的功能和作用机制奠定基础。方法从小鼠基因组DNA采用PCR法扩增出pre-miR-122基因,测序后克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP逆转录病毒载体上,测序鉴定,病毒包装后,转染NIH3T3细胞,并通过绿色荧光蛋白进行病毒滴度测定。将重组慢病毒感染肝前体细胞(HPCs),利用实时定量PCR检测miR-122的表达。结果重组慢病毒载体pCDH-CMV-miR-122-EF1-copGFP经PCR扩增及测序鉴定正确,并得到了滴度为(1～5)×106IU/mL的病毒液。pCDH-CMV-miR-122-EF1-copGFP感染的肝前体细胞中miR-122表达显著增强。结论成功构建了小鼠miR-122重组慢病毒,并在肝前体细胞中高效表达出miR-122,为进行miR-122的功能和机理奠定了良好的基础。

改良腹腔镜Swenson与Soave术对儿童短段型先天性巨结肠疗效差异

目的对腹腔镜Soave术(LS)和改良腹腔镜Swenson术(MLSw)在儿童短段型巨结肠的治疗效果和并发症进行比较分析。方法回顾分析我科自2007年3月至2016年12月收治的77例儿童短段型巨结肠临床资料。LS术26例,MLSw术51例。收集两组术前、术中和术后临床资料进行分析,随访12~48个月。结果 MLSw组平均手术时间、术中出血量和住院时间比LS组少。两组术后平均进食时间无明显差异。MLSw组术后早期并发症的发生率较LS组低,但两组术后晚期并发症发生率无明显差异。结论 LS和MLSw术都适用于儿童短段型巨结肠的治疗。但MLSw操作更简单,术后早期的排便控制更好。更重要的是,MLSw术可完全切除无神经节细胞肠段,而无需保留直肠肌鞘。

RNAi抑制NANOG表达对肝癌细胞HepG2中MDR1表达及阿霉素敏感性的影响

目的探讨抑制NANOG表达对肝癌细胞HepG2中多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1,MDR1)表达及阿霉素敏感性的影响。方法将靶向NANOG基因的特异性siRNA转染肝癌细胞HepG2,Real-time PCR和Western blot检测siRNA沉默NANOG基因后NANOG、MDR1 mRNA和蛋白的表达,平板克隆形成实验检测沉默NANOG基因后对细胞增殖能力的影响,流式细胞术检测沉默NANOG基因后对细胞周期的影响,CCK-8法检测沉默NANOG基因后HepG2细胞对阿霉素的敏感性情况。结果靶向NANOG基因特异性siRNA转染肝癌细胞HepG2后,能有效抑制NANOG mRNA和蛋白表达,与Mock组比值分别为(0.32±0.05)和(0.38±0.08);与Mock组比较,沉默NANOG基因后,细胞克隆形成率下降[(8.51±3.63)%vs(17.13±2.24)%,P<0.05],进入G0/G1期的细胞比例增多[(75.33±8.21)%vs(57.81±5.05)%,P<0.05],HepG2细胞对阿霉素的敏感性增强(P<0.05),HepG2细胞内MDR1 mRNA和蛋白表达下降,与Mock组比值分别为(0.35±0.06)和(0.41±0.08)。结论抑制NANOG表达可引起肝癌细胞HepG2中MDR1的表达下调并增强细胞对阿霉素的敏感性。

应用淤胆血清“病理微环境”从ESC中筛选肝干细胞的研究

目的:探讨淤胆血清"病理微环境"培养体系诱导胚胎干细胞(ESC)向肝细胞分化的效果及对肝干细胞的筛选作用。方法:将小鼠ESC细胞系E14在无白血病抑制因子培养基中培养,使其自发分化为拟胚体,加入FGF-4和HGF初步诱导,然后置于5%淤胆鼠血清"病理微环境"筛选培养液中继续培养2周,然后进行细胞形态学观察,ALB和CK8/18免疫荧光染色,电镜检查和吲哚氰绿(ICG)摄取试验。结果:经初步诱导分化的ESC置于5%淤胆血清"病理微环境"筛选培养液中培养,初期细胞生长受抑制,部分细胞坏死、凋亡并脱落。1周左右可见上皮样细胞集落呈优势生长。2周左右可见较多肝细胞样集落形成单位(H-CFU),大部分细胞分化为多角形的肝细胞样细胞,呈现较好的均质性,从中央到周边呈逐渐分化成熟的趋势;免疫荧光染色显示ALB和CK8/18表达;电镜检查可见与肝细胞相似的超微结构;吲哚氰绿(ICG)摄取试验可见大量ICG阳性细胞,提示这些细胞具备部分肝细胞特性,且筛选诱导组ICG阳性率显著高于对照组(P<0.05)。结论:采用含淤胆血清的"病理微环境"培养体系从经FGF-4和HGF初步诱导的胚胎干细胞中有效筛选出了具有功能的肝细胞样细胞。

miRNA-122促进小鼠胚胎干细胞源性肝前体细胞的分化与成熟

目的:通过miRNA-122(miR-122)转染胚胎干细胞(ESCs)源性肝前体细胞,观察及评估其是否能推进ESCs向肝细胞的分化过程。方法:采用丁酸钠、成纤维细胞生长因子4(FGF-4)及地塞米松(Dex)联合序贯诱导小鼠ESCs使之初步分化为肝前体细胞,然后利用Gateway技术构建出pAV.Ex1d-CMV>miR122/IRES/eGFP重组腺病毒表达载体,使其转染贴壁诱导第9天的小鼠ESCs源性肝前体细胞,获得稳定高表达miR-122的细胞后继续培养。采用荧光显微镜观察转染后细胞形态的变化;使用real-time RT-PCR检测肝特异性基因的表达;免疫荧光检测肝特异性蛋白表达水平;吲哚氰绿摄取实验、糖原染色及尿素合成功能实验检测肝细胞功能。结果:丁酸钠、FGF-4及Dex联合序贯诱导可将小鼠ESCs成功地诱导为肝前体细胞。转染miR-122后,细胞在形态学上更接近成熟肝细胞;肝特异性基因白蛋白(ALB)、甲状腺素运载蛋白、α1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、细胞角蛋白8、胆固醇7α-羟化酶及细胞色素P450 3A4的mRNA表达均增高;肝特异性蛋白ALB及细胞角蛋白18均表达增高,而甲胎蛋白表达降低;吲哚氰绿摄取实验、糖原染色及尿素合成功能实验结果均显示转染miR-122后肝细胞功能较对照组明显增强。结论:丁酸钠、FGF-4及Dex联合序贯诱导可将小鼠ESCs成功地诱导为肝前体细胞;miR-122能够有效地促进小鼠肝前体细胞的分化与成熟。

沉默NANOG表达对人肝癌细胞HepG2中cyclin D1表达及细胞增殖的影响

目的:探讨RNA干扰沉默NANOG表达后对肝癌细胞HepG2中细胞周期素D1(cyclin D1)表达及细胞增殖的影响。方法:将以NANOG基因为靶点的NANOG-siRNA瞬时转染肝癌细胞HepG2,real-time PCR和Western boltting检测NANOG、cyclin D1 mRNA和蛋白的表达,CCK-8和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期情况。结果:与mock组比较,转染NANOG-siRNA后,肝癌细胞HepG2中NANOG、cyclin D1mRNA和蛋白水平均下调(P<0.05),细胞增殖能力下降(P<0.05),进入G0/G1期的细胞比例增多(P<0.05)。结论:沉默NANOG表达可引起肝癌细胞HepG2中cyclin D1的表达下降,导致细胞增殖能力下降。

NANOG基因在侧群表型干细胞样肝癌细胞中的表达及意义

【目的】基于侧群(SP)细胞分选方法,从肝癌细胞Huh7和Hep3B中分选SP表型干细胞样肝癌细胞,观察干细胞标记物NANOG基因在该SP表型肝癌细胞中的表达。【方法】采用流式细胞术检测和分选肝癌细胞Huh7和Hep3B中的SP细胞和非侧群(NSP)细胞,细胞生长曲线法检测SP和NSP细胞的增殖能力,Transwell侵袭实验检测SP和NSP细胞的侵袭能力,MTT法检测SP和NSP细胞对5-氟尿嘧啶(5-FU)和阿霉素(DOX)的药物敏感性;Real-time PCR和WB检测SP与NSP细胞中NANOG基因的表达。【结果】肝癌细胞Huh7和Hep3B中分选的SP细胞比例分别为(5.3±0.8)%和(13.49±1.0)%。生长曲线表明Huh7和Hep3B的SP细胞的增殖速度快于NSP细胞(P<0.05),体外侵袭实验结果显示Huh7和Hep3B的SP细胞体外侵袭能力高于NSP细胞(P<0.05),MTT结果显示Huh7和Hep3B SP细胞对5-FU和DOX有耐药性,高于NSP细胞(P<0.05)。Huh7和Hep3B SP细胞NANOG mRNA平均表达水平分别是NSP细胞的4.17和5.51倍(P<0.05),NANOG蛋白平均表达水平分别是NSP细胞的3.78和5.01倍(P<0.05)。【结论】肝癌细胞Huh7和Hep3B中分选的SP细胞符合肿瘤干细胞的部分生物学特征,NANOG基因在SP表型干细胞样肝癌细胞中高表达。

小儿腹腔镜阑尾切除与开腹阑尾切除的临床对比研究

目的 对比研究小儿腹腔镜阑尾切除术（LA）与传统开腹阑尾切除术（OA）的临床疗效及安全性.方法 回顾性分析2009年1月～2012年12月期间进行LA和OA的93例小儿阑尾炎患者的临床资料,对两组手术时间、术中出血情况、术后恢复情况等进行统计对比分析.结果 两组患儿手术及恢复顺利,术后无严重并发症.两组手术时间及术中出血量差异均无统计学意义（P＞0.05）;LA组术后肛门排气时间、下床活动时间、切口疼痛时间、术后住院天数均低于OA组,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 与OA比较,小儿LA具有创伤小、并发症少,恢复快及美容等优势,是治疗小儿阑尾炎理想的手术方式.

MYCN-siRNA和神经生长因子联合诱导神经母细胞瘤细胞分化凋亡的实验研究

目的:探讨应用MYCN-siRNA和神经生长因子(NGF)联合诱导神经母细胞瘤细胞分化凋亡的分子机制。方法:实验分组包括MYCN-siRNA与NGF联合诱导组、NGF诱导组、siRNA诱导组和空白对照组。观察各实验组神经母细胞瘤细胞的形态学变化及细胞的增殖变化,通过Real-TimePCR检测MYCN-mRNA和NSE的表达、Western Blot检测MYCN基因沉默后MYCN蛋白的表达情况。结果:神经母细胞瘤MYCN基因沉默后,RT-PCR检测IMR-32细胞MYCN-mRNA表达的抑制率达到89%;Western Blot检测IMR-32转染MYCN-siRNA后的第3天MYCN蛋白的表达率达到最低,表达率下降至26.6%。在NGF和MYCN-siRNA的共同作用下,神经母细胞瘤细胞出现了较明显的细胞形态学分化,细胞的增殖能力明显下降,IMR-32细胞NSE的表达明显下降。结论:MYCN-siRNA和NGF联合诱导神经母细胞瘤细胞,可使MYCN-mRNA的表达和NSE的表达均明显下降,并促进神经母细胞瘤细胞分化凋亡。

394例小儿可触及隐睾的腹腔镜治疗体会

目的:探讨腹腔镜在小儿可触及隐睾手术中的应用价值。方法:分析了2012年1月至2020年6月,我院小儿外科收治的394例隐睾患儿,分别施行腹腔镜睾丸下降固定术;腹腔镜结扎鞘状突,直接于阴囊取切口行睾丸下降固定术;腹腔镜打开同侧鞘状突,将睾丸拉入腹腔分离,再行睾丸下降固定术。结果:394例可触及隐睾患儿中双侧隐睾有113例(28.7%),右侧隐睾有160例(40.6%),左侧隐睾有121例(30.7%)。其中有325例存在一侧或双侧鞘状突未闭,均在术中同时行腹腔镜下鞘状突高位结扎术。另有6例患儿,术中发现同侧鞘状突已闭合,但睾丸位于腹股沟中段,遂于腹腔镜下打开鞘状突,将睾丸拉入腹腔分离后行睾丸下降固定术。394例患儿均能Ⅰ期将睾丸下降及固定于阴囊,术后均不存在腹股沟区切口。结论:腹腔镜下治疗小儿可触及隐睾,可以更彻底地分离精索血管及输精管,创伤小,手术效果好,术后美观,在临床中值得推广。

应用商环行小儿改良包皮环切术800例治疗体会

目的探讨应用商环行改良包皮环切术的临床效果。方法应用商环行改良性包皮环切术,用3把血管钳提起包皮口,将商环内环倾斜塞入龟头与包皮内板之间,再将商环外环套于包皮外板外并卡紧,对800例患儿行包皮环切术,分析其手术时间、出血量、脱环时间、术后并发症、术后外观满意情况。结果手术时间为4.65±1.25 min,平均出血量<3 mL,术后并发症主要为感染0.50%(4/800)、包皮明显水肿3.12%(25/800)、伤口裂开0.25%(2/800)、伤口出血0.25%(2/800),脱环时间14±5 d,术后再粘连2.25%(18/800),外观满意率达99.38%(795/800),98.13%(785/800)的家长觉得治疗费用合理。结论应用商环行小儿改良包皮环切术,手术时间短、出血量少、术后并发症少、外观满意率高,是治疗小儿包茎、包皮过长的良好方法,具有优势。

大鼠脂肪干细胞向肠神经样干细胞转分化的初步实验研究

目的初步探讨应用小分子SB431542、noggin和LDN1931897将大鼠脂肪干细胞(ADSCs)转分化成肠神经样干细胞的可行性,为先天性巨结肠的细胞治疗提供一种新的种子细胞。方法取SD大鼠腹股沟脂肪组织分离培养ADSCs。当ADSCs传代至第3代时,加入小分子SB431542、noggin、LDN1931897以及肠神经培养基进行转分化实验。通过光学显微镜观察细胞形态学变化和应用免疫荧光染色检测其肠神经干细胞特异性标记物表达情况。结果ADSCs在含有3种小分子的肠神经细胞培养基中转分化培养7天后形成神经球样的细胞团。免疫荧光染色法检测发现神经干细胞特异性标记物Nestin呈阳性表达,肠神经干细胞标记物Sox2呈阳性表达。结论小分子SB431542、noggin和LDN1931897可在肠神经培养基中将ADSCs转分化为肠神经样干细胞。ADSCs有可能作为先天性巨结肠干细胞移植的种子细胞来源。

人FoxA1基因重组慢病毒载体的构建和鉴定

目的构建叉头盒蛋白A1（Forkhead-box A1,Fox A1）的重组慢病毒表达载体,为探究其功能和作用机制奠定基础。方法设计基因引物,采用聚合酶链反应（PCR）扩增出Fox A1的c DNA序列,然后将其克隆至PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro慢病毒表达载体上,经PCR、双酶切反应及DNA测序鉴定,将阳性重组Fox A1表达载体、p CMV-VSV-G和p CMV-d R8.91包装质粒共转染到HEK-293T细胞进行病毒包装收集病毒浓缩液,然后再感染293T细胞,通过观察绿色荧光蛋白来计算病毒滴度,最后用病毒转染原代培养人皮肤成纤维细胞（HFFs）,通过实时荧光定量PCR检测Fox A1 m RNA的表达水平。结果重组慢病毒表达载体Fox A1经PCR扩增、酶切及测序鉴定正确,并得到滴度为1×10~8 TU/m L的病毒液,病毒感染人皮肤成纤维细胞后表达显著增强。结论成功构建了人Fox A1重组慢病毒载体,并可在HFFs内高效表达,为后续Fox A1的功能和机理研究奠定了实验基础。

先天性巨结肠的腹腔镜治疗体会

目的探讨腹腔镜技术在小儿先天性巨结肠治疗中的应用。方法对12例先天性巨结肠患儿行腹腔镜Swenson手术,其中短段型3例,普通型8例,长段型1例。结果 12例患者均在腹腔镜下完成手术,无中转开腹病例。手术切除痉挛段和扩张段病变肠管送病理检查,其中最短者约15cm,最长者约60cm。术后病理均显示符合先天性巨结肠诊断。所有病例均未出现吻合口漏、尿潴留、肛周感染等并发症。术后随访3～12个月,所有病例排便功能恢复良好,而且无大便失禁和便秘症状。结论腹腔镜先天性巨结肠根治术创伤小、术后恢复快,手术安全,效果满意。

丙型肝炎病毒核心蛋白对肝癌细胞stat3通路及细胞周期蛋白cyclin D1的调控作用

【目的】探讨丙型肝炎病毒核心蛋白(HCVc)是否调控肝癌细胞中stat3通路及细胞周期蛋白cyclin D 1的表达,参与肝癌细胞的恶性生物学行为。【方法】将含HCVc基因的真核表达质粒pEGFP-N3-HCVc瞬时转染人肝癌细胞HepG2使HCVc过表达,用siRNA-HCVc敲除HepG2细胞中HCVc的表达,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,Western blot检测HCVc、总stat3(stat3)、磷酸化stat3(p-stat3)及cyclin D1蛋白的表达;流式细胞术及MTT法检测细胞周期变化及细胞增殖情况。【结果】Western blot结果显示,通过瞬时转染而过表达HCVc的HepG2细胞中,HCVc、p-stat3及cyclin D1的蛋白水平高于空白质粒转染组和未转染组;siRNA-HCVc敲除HCVc表达后,HCVc、p-stat3和cyclin D1蛋白的表达下调;酪氨酸磷酸化抑制剂AG490(JAK2特异性拮抗剂)处理可下调过表达HCVc的HepG2细胞中p-stat3和cyclin D1蛋白的表达。流式细胞术显示过表达HCVc可促进细胞向G 2/M期进展。MTT法结果显示过表达HCVc使HepG2细胞增殖能力增加。【结论】HCVc可活化HepG2细胞中stat3通路,调控细胞周期蛋白cyclin D1的表达,促进细胞周期进展及细胞增殖,可能与肝癌的发展有关。

人肝脏特异性miR-122重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建microRNA-122(miR-122)的重组过表达慢病毒,并对其进行病毒包装、鉴定与滴度测定,为进一步研究miR-122的功能和作用机制奠定基础。方法利用PCR法扩增人类基因组DNA中miR-122发夹前体结构RNA,并将其克隆至PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro慢病毒表达载体上,经酶切及基因测序鉴定,将阳性重组PCDH-CMV-miR-122-EF1a-GFP-puro表达载体、p CMV-VSV-G和p CMVdR8.91三质粒共转染到HEK-293T细胞,收获上清液,将所得病毒悬液浓缩后梯度稀释后感染HEK-293T细胞,并利用绿色荧光蛋白进行病毒滴度测定。将重组慢病毒转染原代培养人皮肤成纤维细胞,并利用实时定量PCR检测miR-122的表达。结果重组慢病毒表达载体PCDH-CMV-miR-122-EF1a-GFP-puro酶切及测序鉴定证明载体构建成功,并得到滴度为3×108TU/m L的病毒液。病毒感染人皮肤成纤维细胞后miR-122表达明显增强。结论通过优化miRNA载体构建方法成功构建人miR-122的重组慢病毒载体并可在人类成纤维细胞内显著过表达miR-122,为miR-122的研究提供更高效稳定的基因载体。

人肝细胞核因子4α重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4 alpha,HNF4A)的过表达慢病毒载体,并对其进行病毒包装、鉴定与滴度测定,为进一步研究HNF4A的功能和作用机制奠定基础。方法利用PCR法扩增人类基因组DNA中HNF4A的cDNA序列,并将其克隆至PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro慢病毒表达载体上,经双酶切及测序鉴定,将阳性重组PCDHCMV-HNF4A-EF1a-GFP-puro表达载体、pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.91三质粒共转染到HEK-293T细胞,收集上清,将获得的病毒悬液浓缩后梯度稀释后感染HEK-293T细胞,并利用绿色荧光蛋白检测病毒滴度。将重组慢病毒感染原代培养人皮肤成纤维细胞HFFs,并利用荧光定量PCR检测HNF-4A的表达。结果重组慢病毒表达载体PCDH-CMV-HNF4A-EF1a-GFP-puro酶切及测序鉴定证明载体构建成功,并得到滴度为1×108 TU/mL的病毒液。病毒感染人皮肤成纤维细胞后HNF4A表达显著增强。结论通过优化载体构建方法成功构建人HNF4A的重组慢病毒载体并可在HFFs内显著过表达HNF4A,为HNF4A的研究提供更高效稳定的基因载体。

应用生物信息学挖掘肝母细胞瘤发病差异基因

目的筛选肝母细胞瘤(hepatoblastoma)组织与小儿正常肝脏组织中的差异表达基因,探究肝母细胞瘤的发病机制,为其诊断和治疗提供新方向。方法从GEO数据库中检索获取肝母细胞瘤组织和小儿正常肝脏组织的芯片数据,通过R语言软件RSTUDIO筛选芯片中的差异表达基因,使用DAVID数据库对筛选所得的差异表达基因进行功能注释,通过STRING数据库构建蛋白质相互作用网络,并进行中心性分析。结果经筛选共获得肝母细胞瘤组织中290个差异表达基因,其中上调基因99个,下调基因191个(P<0.05)。GO(Gene Ontology)功能注释分析显示,上调差异基因主要涉及细胞分裂、细胞外外泌体、金属离子结合等94个功能簇,下调差异基因主要涉及脂蛋白代谢、细胞外外泌体、血红素结合等100个功能簇。蛋白质相互作用网络分析示IMPDH2、AGXT、ALDH1A1、ALDH2、PFAS、SERPINC1、AGXT2、KNG1、APOA1、MAT1A、APOC3和HSD17B6 12个基因为与其他节点关系最密切的核心调控基因。结论通过多种生物信息学方法联合分析三组高通量基因芯片,获得了肝母细胞瘤组织与正常小儿肝脏组织间的差异表达基因,并进一步从不同角度分析肝母细胞瘤异常增殖、转移等恶性生物学过程的发生机制,为肝母细胞瘤的诊断和治疗提供新方向。

人肝细胞核因子4α联合组蛋白去乙酰化酶和甲基化转移酶抑制剂诱导成纤维细胞转分化为肝细胞的研究

目的 利用人肝细胞核因子4α（HNF4A）与表观遗传修饰[组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）＋甲基化转移酶抑制剂（DNMTi）]联合诱导人成纤维细胞向肝细胞转分化，建立更为高效、新型的肝细胞转分化方法。 方法取第6～8代人皮肤成纤维细胞，置于5’氮杂胞苷（5-AzaC）与丙戊酸（VPA）中，并感染HNF4A重组慢病毒共同诱导20 d。用倒置相差显微镜动态观察诱导过程中的细胞形态变化，实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测并分析肝细胞特异性基因的表达，吲哚菁绿摄取实验、糖原过碘酸-无色品红（PAS）染色和尿素合成功能实验验证生物学功能。 结果 诱导过程中，细胞形态逐渐由长梭形转变为上皮样形态，并逐渐开始过表达肝特异基因及表现生物学功能。诱导第20天，细胞在形态学上有明显肝细胞上皮样变化，胞质丰富、核大而圆深染且核仁明显；Real-time PCR检测肝特异性基因均有不同程度的表达上调，以白蛋白（ALB）及转铁蛋白（TF）最显著，分别为118%及250%，差异有统计学意义（t＝7.418、5.131，P＝0.002、0.001）；吲哚菁绿摄取实验结果显示约35%呈阳性细胞；70%细胞呈糖原PAS染色阳性；尿素合成动态检测可见诱导细胞尿素分泌量呈逐增多趋势，到达肝样细胞（iHEPs）期（第20天），每106个细胞合成的尿素氮量达到了等量正常肝细胞合成的55%，即iHEPs从生物学功能上均显示转分化肝样细胞肝功能部分接近正常肝细胞水平。结论 HNF4A与表观遗传修饰（HDACi＋DNMTi）可以联合诱导人成纤维细胞转分化为肝细胞样细胞，肝样细胞在基因表达及生物学功能部分接近正常肝脏细胞。

hsa_circ_0005777在肝母细胞瘤中的表达及对细胞增殖周期的影响研究

目的探索环状RNA hsa_circ_0005777在肝母细胞瘤中的表达及对肝母细胞瘤细胞增殖周期的影响。方法实验细胞包括人肝母细胞瘤细胞株HepG2和HUH6,将实验细胞培养在含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM培养基中,置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中。实验组织标本包括肝母细胞瘤肿瘤及癌旁组织标本,来源于中山大学孙逸仙纪念医院小儿外科住院患儿手术切除的组织。所有肿瘤组织标本和癌旁组织标本在手术切除后,均立即浸泡在RNA later保存液中防止RNA降解,随后放在-80℃冰箱保存。在肝母细胞瘤细胞株中转染hsa_circ_0005777过表达质粒,为过表达组;未转染过表达质粒的细胞株作为阴性对照,为对照组。检测内容包括:①鉴定hsa_circ_0005777在肝母细胞瘤细胞株中的性质及分布情况;②检测hsa_circ_0005777在肝母细胞瘤肿瘤、癌旁组织组织标本和肝母细胞瘤细胞株中的表达情况;③检测过表达组对肝母细胞瘤细胞株细胞增殖能力的影响;④检测过表达组对肝母细胞瘤细胞株细胞周期的影响及过表达组对细胞周期蛋白Cyclin D1表达水平的影响。结果①hsa_circ_0005777在肝母细胞瘤细胞株中成环并富集在细胞质中;②hsa_circ_0005777在肝母细胞瘤组织标本中的表达显著高于癌旁组织,在肝母细胞瘤肿瘤组织标本及细胞株中明显高表达;③过表达组可明显提高肝母细胞瘤细胞株的增殖能力;④过表达组可明显促进细胞周期蛋白Cyclin D1的表达,可促进肝母细胞瘤细胞株细胞G1/S期转化。结论hsa_circ_0005777可促进肝母细胞瘤肿瘤细胞增殖,有望成为治疗肝母细胞瘤的新靶点。