烟草烟雾暴露小鼠中CD4^+ Foxp3^+调节性T细胞亚型与Th1/Th17变化的实验研究

目的:探讨烟草烟雾暴露后小鼠CD4^+Foxp3^+调节性T细胞(Treg细胞)亚型及Th1、Th17细胞比例的变化及其意义。方法:将20只雄性Balb/c小鼠随机分为对照组和烟熏组,烟熏组小鼠烟草烟雾暴露24周建立肺气肿模型。采用苏木精—伊红(HE)染色法观察小鼠肺组织形态学改变。流式细胞术检测小鼠外周血、脾脏和肺组织中Treg细胞亚型及Th1、Th17的比例变化。结果:烟熏组肺泡平均内衬间隔(MLI)为(53.3±8.9)μm,明显高于对照组的(28.0±1.2)μm(P<0.01)。与对照组比较,烟熏组外周血、脾脏和肺组织中Th1、Th17细胞比例均升高(P<0.05),记忆型Treg细胞(CD4Foxp3^+CD44^+CD62^+)、效应型Treg细胞(CD4Foxp3^+CD44^+CD62-)比例升高,幼稚型Treg细胞(CD4Foxp3^+CD44^-CD62^+)比例下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:烟草烟雾暴露肺气肿小鼠体内Treg细胞亚型参与了气道炎症免疫调节,可能有助于减少Th1、Th17细胞的表达并减轻肺部炎症反应。

香烟烟雾暴露小鼠中CD4^+Foxp3^+调节性T细胞中组蛋白去乙酰化酶的表达及意义

目的:探讨香烟烟雾暴露小鼠CD4+Foxp3+调节性T细胞(Treg细胞)中组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的表达及意义。方法:将40只健康的雄性Balb/c小鼠随机分为对照组、HDAC阻滞剂曲古菌素A(TSA)组、烟熏组、烟熏+TSA组。烟熏组香烟烟雾暴露24周建立小鼠肺气肿模型,苏木精—伊红(HE)染色观察小鼠肺组织形态学改变。免疫磁珠分选纯度大于90%的Treg细胞,实时荧光定量PCR(qPCR)法检测Treg细胞中HDAC2、HDAC5、HDAC7、HDAC9等mRNA表达水平。流式细胞术检测Treg细胞中表达细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)的比率、Treg增殖能力及其对效应Teff细胞增殖抑制作用。结果:烟熏组的平均内衬间隔(MLI)为(53.1±8.7)μm,明显高于对照组的(28.2±1.2)μm(P<0.05),成功建立肺气肿模型。与对照组比较,TSA组和烟熏组Treg细胞HDAC2、HDAC5、HDAC7、HDAC9 mRNA相对表达量降低,Treg细胞中CTLA-4表达率及其分裂指数升高,Teff细胞分裂指数下降(P<0.05);加入TSA进行体外干预后,与烟熏组比较,烟熏+TSA组Treg细胞CTLA-4表达率升高,Treg细胞增殖能力及对效应Teff细胞的增殖抑制作用均增强(P<0.05)。结论:在香烟烟雾诱导的肺气肿小鼠中,CD4+Foxp3+Treg细胞HDAC表达下降,HDAC可能参与吸烟所致的Treg细胞免疫功能失衡。

CD4^＋Foxp3^＋调节性T细胞对断烟大鼠肺部炎症及肺气肿的作用

目的观察香烟暴露及断烟后大鼠Treg细胞的变化，探讨Treg细胞与断烟后大鼠肺部炎症反应和肺气肿持续存在的关系。方法将50只雄性Wistar大鼠按随机数字表法分为5组：健康对照组、香烟暴露组和断烟组，其中健康对照组和香烟暴露组又分为12周组（对照1组和实验1组）和24周组（对照2组和实验2组）。香烟烟雾暴露法建立大鼠肺气肿模型。HE染色观察大鼠肺气肿的改变，酶联免疫吸附法检测大鼠BALF中白细胞介素（IL-8）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平，流式细胞术检测大鼠外周血和肺实质中CD4^±Foxp3调节性T细胞（Treg细胞）比例，实时定量PCR法检测大鼠外周血和肺实质中Foxp3的mRNA表达。多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用SNK和Games—Howell检验。结果实验1组和实验2组平均内衬间隔（MLI）为（64．9±5．3）μm和（77．9±11．5）μm，均明显高于对照1组和对照2组的（39．0±3．8）μm和（40．3±2．7）μm，差异均有统计学意义（P〈0．01）；断烟组MLI[（71．5±5．8）μm]介于实验1组和实验2组之间，但肺气肿程度较实验1组明显加重，差异有统计学意义（P〈0．01）。实验1组和实验2组IL-8水平[（68±17）ng／L和（85±16）ng／L]及TNF-α水平[（14．1±1．8）ng／L和（20．1±8．7）ng／L]均明显高于对照1组和对照2组[（44±8）ng／L、（43±9）ng／L及（6．3±2．3）ng,／L、（5．8±1．6）ng／L]，差异均有统计学意义（P〈0．05）。实验1组和实验2组肺实质中CD4^＋Foxp3^＋Treg细胞[（6．6±0．8）％和（5．3±0．9）％]明显少于对照1组和对照2组[（9．0±1．0）％和（9．6±0．9）％]，差异均有统计学意义（P〈0．01）；断烟组肺实质中CD4^＋Foxp3^＋Treg细胞[（7．2±0．6）％]与实验1组比较虽无明显减少，但未能恢复至正常水平。实验1组和实验2组肺实质中Foxp3的mRNA表达量（17±7和9±7）明显低于对照1组和对照2组（39±6和42±7），差异均有统计学意义（P〈0．01）；断烟组肺实质中Foxp3的mRNA表达量（21±9）与实验1组比较未见明显减少，但未能恢复至正常水平。结论香烟暴露肺气肿大鼠肺内调节性T细胞下调可能导致大鼠肺内炎症反应放大，并在断烟后持续存在，提示调节性T细胞下调可能是大鼠肺气肿持续进展的原因之。

免疫反应在慢性阻塞性肺疾病和肺气肿发生及发展过程中的作用

COPD是具有气流受限特征的疾病，气流受限不完全可逆，呈进行性发展，并与肺部对香烟烟雾等有害气体或有害颗粒的异常炎症有关，这种异常炎症累及各级气道、肺实质和肺血管。目前普遍认为，慢性的肺部炎症在COPD和肺气肿形成中起主要作用。近年来研究结果显示，T细胞介导的炎症反应参与COPD和肺气肿的发生与发展过程，并与疾病的严重程度相关，提示免疫反应可能在其中起重要作用。

大环内酯类药物治疗慢性阻塞性肺疾病现状及启示

慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)主要与烟草烟雾等有害气体及有害颗粒的慢性炎症反应增强有关,如何早期、有效地抗炎治疗是目前慢阻肺治疗的难点。现有的抗炎方法不能满足临床需求,亟待新的抗炎药物和治疗靶点。大环内酯类药物作为抗炎药物已应用于多种气道慢性炎症性疾病,且目前在慢阻肺的应用研究有很大进展,有希望成为今后慢阻肺的有效抗炎治疗药物之一。

终止香烟烟雾暴露后大鼠Th1/Tc1介导气道炎症及调节性T细胞的变化

目的 观察香烟烟雾暴露和终止香烟烟雾暴露后大鼠Th1/Tc1介导气道炎症及支气管肺泡灌洗液（BALF）中调节性T细胞（Treg）的变化.方法 将50只健康清洁级雄性Wistar大鼠随机分为5组：12周正常对照组（简称12周对照组）、24周正常对照组（简称24周对照组）、12周香烟烟雾暴露组（简称12周暴露组）、24周香烟烟雾暴露组（简称24周暴露组）、终止香烟烟雾暴露组（简称终止暴露组）.烟熏法复制大鼠气道炎症的动物模型.12周后,12周对照组、12周暴露组处置取材,24周暴露组继续烟熏12周,终止暴露组终止烟雾暴露12周,将后2组及24周对照组处置取材.HE染色观察小气道病理改变,进行气道评分 收集BALF进行细胞学计数和分类计数 酶联免疫吸附法（ELISA）法测BALF中4种细胞因子：Th1/Th2型细胞因子干扰素（IFN）γ、白细胞介素（IL）4及促炎因子IL-8、肿瘤坏死因子（TNF）α的浓度 流式细胞术检测各组大鼠BALF中Treg细胞的比例,RT-PCR检测各组大鼠BALF中Foxp3 mRNA的表达.结果 （1）12周暴露组、24周暴露组、终止暴露组气道炎症评分较12周对照组、24周对照组明显高（均P＜0.01）.24周暴露组、终止暴露组气道炎症评分均较12周暴露组高（均P＜0.01）.（2）与12周对照组、24周对照组相比,12周暴露组、24周暴露组、终止暴露组BALF中IFN-γ、TNF-α和IL-8高,IL-4低（均P＜0.01）.与12周暴露组相比,终止暴露组IFN-γ、IL-4、TNF-α差异均无统计学意义（均P＞0.05）,IL-8较高（P＜0.01）,24周暴露组IFN-γ、TNF-α和IL-8明显高（均P＜0.01）.（3）BALF中Treg细胞比例,12周暴露组（7.4%±0.8%）、24周暴露组（7.8%±1.7%）、终止暴露组（7.0%±1.4%）较12周对照组（4.8%±1.2%）、24周对照组（4.7%±1.2%）高（均P＜0.01）,前3组之间BALF中Treg细胞比例差异均无统计学意义（均P＞0.05）.（4）12周暴露组（0.22±0.02）、24周暴露组（0.23±0.03）、终止暴露组（0.20±0.04）BALF中Foxp3 mRNA表达较12周暴露组（0.13±0.01）、24周暴露组（0.11±0.02）高（均P＜0.01）.前3者之间BALF中Foxp3 mRNA表达差异均无统计学意义（均P＞0.05）.结论 香烟暴露致大鼠气道Th1/Tc1介导炎症伴Treg细胞表达增高,终止香烟烟雾暴露后其炎症及Treg细胞高表达仍持续存在,提示该免疫失衡可能是导致终止香烟暴露后Th1/Tc1气道炎症仍持续进展的原因之一.

红霉素对香烟诱导的大鼠支气管肺泡灌洗液中调节性T细胞的影响

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonarydisease，COPD）是一种主要由吸烟诱发的以Th1为主的气道炎症，存在的Th1/Th2失衡介导的炎症反应和自身免疫反应是激活中性粒细胞和巨噬细胞等效应细胞发挥损害肺泡细胞和产生降解间质成分作用并最终导致肺气肿的关键所在。

CD40对烟草烟雾暴露肺气肿小鼠肺部CD8＋T细胞毒性功能的影响

目的探讨CD40对烟草烟雾暴露肺气肿小鼠肺部CD8^＋T细胞毒性功能的影响。方法40只雄性C57小鼠按随机数字表法随机分为CD40^＋/＋对照组、CD40^＋/＋烟熏组、CD40^-/-对照组、CD40^-/-烟熏组4组，烟熏组采用烟草烟雾暴露24周建立小鼠肺气肿模型。各组肺组织分别采用HE染色观察肺部病理改变并计算肺泡平均内衬间隔；免疫组织化学法检测CD8^＋T细胞和穿孔素^＋、颗粒酶B^＋细胞百分比；实时荧光定量PCR（RT—PCR）检测穿孔素、颗粒酶B、白细胞介素（IL）-27mRNA表达；酶联免疫吸附（ELISA）法检测IL-27细胞因子水平。结果CD40^＋/＋烟熏组肺组织明显破坏，可见大量炎症细胞浸润；CD40^-/-烟熏组肺组织破坏及炎症细胞浸润程度较CD40^＋/＋烟熏组轻。CD40^＋/＋烟熏组肺泡平均内衬间隔显著高于CD40^＋/＋对照组、CD40^-/-对照组和CD40^-/-烟熏组[（37．2±3．6）比（24．0±3．4）、（22．5±2．4）、（29．9±1．7）μm]（均P〈0．05）；CD40。一烟熏组高于CINO“’对照组及CD40。一对照组（均P〈0．05）。CD40“’烟熏组CD8^＋、穿孔素^-、颗粒酶B^＋细胞百分比[（16．3±2．3）％、（11．4±2．1）％、（10．7±1．9）％]均显著高于CD40^＋/＋对照组[（8．3±1．6）％、（5．1±1．2）％、（4．6±1．0）％]、CD40^-/-对照组[（6．4±1．5）％、（4．3±1．0）％、（4．2±1．0）％]、CI40^-/-烟熏组[（8．6±1．7）％、（5．6±1．3）％、（5．5±1．3）％]（均P〈0．05）。CD40^＋/＋烟熏组穿孔素、颗粒酶B、IL-27mRNA相对表达量[（20．3士7．3）、（18．3±12．3）、（2．24-0．7）]均显著高于CIMO^＋/＋对照组[（9．4士4．8）、（10．6±3．8）、（1．3±0．6）]、CD40^-/-对照组[（8．1±3．1）、（7．7±3．5）、（1．1±0．5）]、CD40^-/-烟熏组[（12．94-6．2）、（10．4±4．6）、（1．5±0．4）]（均P〈0．05）。CD^＋/＋烟熏组细胞因子IL-27水平显著高于CD40^＋/＋对照组、CD40^-/-对照组、CD40^-/-烟熏组[（3242±754）比（1627±710）、（1600±680）、（1850±583）ng／L]（均P〈0．05）。结论CD40基因敲除可以抑制烟草烟雾暴露肺气肿小鼠肺部CD8^＋T细胞毒性功能，减轻肺气肿程度。

CD40对烟草烟雾暴露小鼠肺组织Foxp3＋Treg细胞的影响

目的观察烟草烟雾暴露下CD40对小鼠肺内叉头／翼状螺旋转录因子阳性调节性T细胞（Foxp3＋Treg）的影响。方法野生型与CD40-/-C57BL／6小鼠各20只，分别按随机数字表法分为两组，即：野生型对照组、野生型烟熏组与CD40-/-对照组、CD40-/-烟熏组，每组各10只。烟熏组香烟烟雾暴露24周建立小鼠肺气肿模型，HE染色观察小鼠肺组织的改变，计算肺泡平均内衬间隔（MLI）。免疫组化法观察肺组织中Foxp3＋细胞百分数，实时定量PCR与Western印迹法检测肺组织中Foxp3mRNA与蛋白的表达。酶联免疫吸附（ELISA）法检测各组小鼠肺组织中白细胞介素（IL）-10，IL-35水平。结果CD40-/-烟熏组MLI显著低于野生型烟熏组[（30．0±1．7）比（37．3±3．7）μm]，高于CD40-/-对照组[（23．2±2．5）±m]，野生型烟熏组显著高于野生型对照组[（22．2±1．7）±m]（均P〈0．05）。CD40-/-烟熏组肺组织中Foxp3＋细胞数量均显著高于野生型烟熏组和CD40-/-对照组[（16．89±0．75）％比（9．65±0．74）％和（13．58±0．51）％]，野生型烟熏组显著低于野生型对照组[（12．13±0．81）％]（均P〈0．05）。CD40-/-烟熏组肺组织中Foxp3的mRNA与蛋白表达量均显著高于野生型烟熏组和CD40-/-对照组，野生型烟熏组显著低于野生型对照组（均P〈0．05）。CD40-/-烟熏组肺组织匀浆中IL-10水平均显著高于野生型烟熏组和CD40-/-对照组[（231±25）比（80±31）和（183±29）ng／L]，野生型烟熏组显著低于野生型对照组[（192±37）ng／L]（均P〈0．05）。CD40-/-烟熏组肺组织匀浆中IL．35水平均显著高于CD40。一对照组、野生型对照组、野生型烟熏组[（2084-29）比（118±29）、（148±36）、（137±37）ng／L]（均P〈0．05）。结论敲除CD40基因可促进烟草烟雾暴露小鼠肺内Treg细胞分化，阻断CD40-/-CD40配体通路可能有助于改善烟草烟雾暴露所致的肺气肿改变。

雷帕霉素对烟草烟雾暴露导致肺气肿小鼠Th1/Th17细胞的影响

为了观察雷帕霉素对烟草烟雾暴露导致肺气肿小鼠辅助性Th1细胞和Th17细胞的影响,将30只C57BL/6小鼠设为空气为暴露组,烟熏组及雷帕霉素干预组,观察分析显示烟草烟雾暴露导致烟熏组小鼠肺泡平均内衬间隔(MLI)、免疫Th1/Th17细胞及炎症因子干扰素(IFN)-γ/IL-17和IFN-γ mRNA和维A酸相关核孤儿受体γt(RORγt)mRNA相对表达量均明显增高而雷帕霉素干预后均显著降低(均P<0.05).进而得出雷帕霉素对小鼠体内Th1/Th17细胞具有抑制作用,可能是其减轻烟草烟雾所致肺气肿和肺部炎症的机制之一.