基于线粒体cox1、nad1和rrn L基因探讨马圆线科线虫间的亲缘关系

为探讨马圆线科线虫(圆线亚科和盅口亚科)间的亲缘关系,对长伞杯冠线虫(Cylicostephanus longibursatum)、冠状冠环线虫(Coronocyclus coronatus)、细口杯环线虫(Cylicocyclus leptostomus)、拉氏杯口线虫(Poteriostomum ratzii)、麦氏副杯口线虫(Parapoteriostomum mettami)和无齿圆形线虫(Strongylus edentatus)6种线虫的线粒体cox1、nad1和rrnL基因进行扩增,与同科相关线虫进行比较分析。然后以线粒体cox1、nad1和rrnL串联序列为标记基因,采用贝叶斯法(Bayesian inference,BI)构建进化树来探讨圆线科线虫间的亲缘关系。结果显示,研究中6种线虫的cox1序列长度均为1578 bp,nad1的序列长度除无齿圆形线虫为879 bp外,其余均为873 bp,rrnL序列长度均不同,大小为959~980 bp。6种线虫的cox1、nad1和rrnL的AT含量分别为67.55%~69.71%、71.36%~73.83%和80.88%~82.59%。圆线科线虫间cox1、nad1和rrnL基因的相似性分别为83.4%~97.9%、79.0%~98.4%和78.8%~98.9%。值得注意的是,圆线亚科的三齿属线虫与盅口亚科的相似性总体要高于同亚科的圆线属。进化分析显示,三齿属并没有与同亚科的圆线属形成独立分支,而是与盅口亚科线虫聚集在一起。在盅口亚科分支中,并非每一属单独形成一独立分支,冠环属和杯冠属最为明显,为复系。基于马圆线虫线粒体cox1、nad1和rrnL的序列和进化分析表明,三齿属线虫与盅口亚科的关系较圆线亚科更近,支持三齿属应隶属于盅口亚科这一假说。

我国东海沿海鱼类异尖科线虫RPA检测方法的建立

异尖科线虫病(Anisakiasis)是一种重要的食源性人兽共患线虫病,主要因食用生的或未煮熟的含异尖科线虫Ⅲ期活的幼虫的海鱼而引起。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA)建立了异尖科线虫RPA的检测方法,首先对东海沿海舟山、温州、宁波、平潭、嘉兴市的九种鱼体内获得的线虫进行分离鉴定,获得了派氏异尖线虫、简单异尖线虫、典型异尖线虫、宫脂线虫和对盲囊线虫,然后根据获得的五种线虫的ITS区设计特异性引物。结果显示:本研究建立的RPA方法可特异性扩增出异尖科线虫340 bp左右的目的基因片段,可特异性检测出异尖科线虫,而对阔节裂头绦虫、华支睾吸虫、东方次睾吸虫、棘颚口线虫检测结果为阴性;优化后在35℃、25 min即可完成检测,其灵敏度可达1 pg/μL,人工污染实验结果显示呈阳性。此方法操作简单、便捷,对现场快速检测具有重要的意义。

华支睾吸虫TIP-C基因的序列分析及原核表达

华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)是一种重要的人兽共患病原,T细胞免疫调节蛋白(TIP)存在于该虫体生长发育的各个阶段,能够抑制T细胞免疫应答,有助于虫体在宿主体内寄生。为了解华支睾吸虫TIP蛋白的生物信息学及原核表达该蛋白,本研究利用DNAStar软件对GenBank中华支睾吸虫TIP基因编码蛋白的生物信息学进行分析,结果显示华支睾吸虫TIP蛋白表面具有较丰富的B细胞抗原表位且集中在其C段(CsTIP-C),具有多个α-螺旋和β-折叠。采用RT-PCR扩增CsTIP-C片段,构建pET-22b-CsTIP-C重组质粒,经双酶切及测序鉴定后,转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后SDS-PAGE检测该蛋白的表达情况,获得的重组蛋白经切胶纯化后进行western blot鉴定。PCR扩增及测序结果显示,扩增得到的CsTIP-C为930 bp,编码309个氨基酸。SDS-PAGE结果显示,CsTIP-C在33 ku处有目的蛋白条带,western blot结果表明该重组蛋白具有良好的反应原性。本研究首次完成了CsTIP-C的克隆表达,并证明该蛋白具有反应原性,为华支睾吸虫病免疫诊断试剂盒的研发奠定了基础。

楔形前殖吸虫核糖体全序列的特征分析

楔形前殖吸虫(Prosthogonimus cuneatus)是禽类和鸟类输卵管、法氏囊和直肠常见的寄生虫之一,对禽和鸟类危害较大。利用PCR对楔形前殖吸虫核糖体全序列进行了扩增,并探讨了其与其他吸虫的进化关系。结果发现,楔形前殖吸虫核糖体全序列长10713 bp,其中18S、ITS1、5.8S、ITS2、28S、IGS的长度分别为1970、1271、161、224、4155、2932 bp;核糖体全序列有15对正向重复序列和34对反向重复序列,正向重复序列全部位于ITS1和IGS区域;基于18S基因的进化分析显示,楔形前殖吸虫与同属的卵圆前殖吸虫及同科的稀有裂睾吸虫聚在同一分支上,与同目的Brachycladiidae和Auridistomidae两科吸虫亲缘关系较其他科近。首次解析了楔形前殖吸虫的核糖体全序列特征,并探讨了其与其他吸虫的进化关系,研究结果为前殖科吸虫的分类学、群体遗传学和系统学研究提供了新资料。

华支睾吸虫副肌球蛋白功能区基因的序列分析及B细胞抗原表位预测

为了阐明华支睾吸虫副肌球蛋白（paramyosin,Pmy）的生物学特性,试验对其功能区的C段（PmyC）基因进行克隆、序列分析及B细胞抗原表位预测,采用TRIzol法提取华支睾吸虫成虫的总RNA,将其反转录成cDNA,再利用PCR方法对PmyC基因进行扩增,将其连接到pMD 18-T载体上进行克隆、测序,并利用DNAStar软件进行序列分析,同时利用生物学软件DNAStar 5. 0对B细胞抗原表位进行预测。结果表明：该虫体PmyC序列长度为903 bp,A＋T含量为52. 6%,与NCBI上的华支睾吸虫囊虫幼、麝后睾吸虫、卫氏并殖吸虫和日本血吸虫核苷酸序列的同源性分别为99. 4%、94. 0%、75. 0%和71. 1%。蛋白二级结构预测显示,PmyC蛋白主要由8个α-螺旋、2个β-折叠和3个β-转角构成。B细胞抗原表位预测显示,在该蛋白中有2个B细胞抗原表位。说明华支睾吸虫副肌球蛋白（CsPmy）具有成为抗原分子的潜能。

华支睾吸虫囊蚴RPA检测方法的建立

为了建立灵敏、快速的鉴别华支睾吸虫诊断方法,本研究根据华支睾吸虫囊蚴的COX-1基因序列设计引物,建立检测华支睾吸虫囊蚴的RPA方法。结果显示:所建立的RPA的灵敏度可达到2.75 ng/μL,而与日本血吸虫、隐孢子虫、阔节裂头绦虫、东方次睾吸虫囊蚴、台湾次睾吸虫囊蚴、异尖线虫和棘颚口线虫均无交叉反应;经条件优化后,可在35℃下5 min内观察到检测结果。另外,在对实际样品检测中,通过添加核酸染料SYBR GreenⅠ,无需PCR仪及紫外凝胶系统的条件下,可以快速地鉴别出华支睾吸虫囊蚴及虫卵。结论,本研究成功地建立了华支睾吸虫囊蚴PRA检测方法,这在食品安全检测中具有重要的应用前景。