西洋参抗心脏肥大的网络药理学分析和实验验证研究

目的:通过网络药理学探讨西洋参多成分、多靶点、多通路的抗心脏肥大作用机制,并选取关键靶点进行细胞实验验证。方法:通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)、中医药百科全书(ETCM)、有机小分子生物活性数据库(PubChem)、多靶点定量构效关系的靶点预测平台数据库(Targetnet)、小分子药物靶点预测在线平台(Swiss Target Prediction)等数据库及参考文献筛选西洋参活性成分及作用靶点。通过人类孟德尔遗传数据库(OMIM)、药物靶标数据库(TTD)及基因名片数据库(GeneCards)筛选心脏肥大相关靶点。将药物的作用靶点与疾病靶点进行交集,获得药物-疾病共同靶点,利用STRING数据库构建PPI网络图,并借助Cytoscape 3.8.0软件进行可视化分析,采用注释、可视化和综合发现(DAVID)数据库对重要靶点进行基因本体(GO)功能与京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。进一步采用异丙肾上腺素诱导的H9c2心肌细胞肥大模型,观察西洋参抗心肌细胞肥大作用,逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测关键靶点的基因表达。结果:从西洋参中筛选出42个活性成分,能够作用于41个心脏肥大相关靶点,其中血管内皮生长因子A(VEGFA)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、表皮生长因子受体(EGFR)、肿瘤坏死因子(TNF)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)等21个靶点是关键靶点,主要涉及一氧化氮合成过程的正调控、脂多糖介导的信号通路、肽基-丝氨酸磷酸化的正调控,参与调节癌症蛋白多糖、血管内皮生长因子(VEGF)信号通路、缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路等。进一步细胞实验结果表明,西洋参100.0μg/mL可抑制异丙肾上腺素10μmol/L诱导的心肌细胞肥大(P<0.05)。在异丙肾上腺素诱导的心肌细胞肥大模型中,VEGFA、AKT1、EGFR、TNF、MAPK1 mRNA表达上调(P<0.05),西洋参可明显抑制上述关键靶点基因表达上调(P<0.05)。结论:西洋参抗心脏肥大的作用机制可能与下调VEGFA、AKT1、EGFR、TNF、MAPK1等多个靶点的基因表达有关。

基于网络药理学研究茶枯提取物的抗血栓作用机制

目的:基于网络药理学研究茶枯提取物的抗血栓作用机制。方法:选择茶枯提取物中16个活性成分,通过Pharm Mapper网络平台预测潜在靶点,通过Gene cards及OMIM网络平台检索血栓相关基因,将两者交集获取茶枯提取物活性成分抗血栓靶点,进而构建PPI网络、活性成分-交集基因-疾病网络,对GO及KEGG通路进行富集分析。结果:共交集得到91个茶枯提取物活性成分抗血栓靶点,主要涉及AKR1B1、MME、CASP3、F2和HSP90AA1。83个GO条目全部涉及分子功能。99条KEGG通路中P值最显著的前5个依次为:流体剪切应力与动脉粥样硬化、催乳素信号途径、百日咳、胰岛素抵抗及补体及凝血级联反应。结论:茶枯提取物抗血栓作用机制涉及多种成分及多个靶点。

基于体外细胞实验和网络药理学研究乳香挥发油抗心脏肥大的作用机制

目的:通过体外细胞实验和网络药理学方法探讨乳香挥发油抗心脏肥大的作用机制。方法:通过异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)诱导的H9c2心肌细胞肥大模型研究乳香挥发油抗心脏肥大的作用。通过CNKI、Pubmed、Pubchem等数据平台检索筛选并收集乳香挥发油活性成分、作用靶点及心脏肥大疾病靶点;利用String数据库和Cytoscape 3.8.0软件构建乳香挥发油抗心脏肥大蛋白互作(PPI)网络和乳香挥发油“药物-活性成分-关键靶点-疾病”网络,筛选分析乳香挥发油抗心脏肥大的关键靶点,并采用荧光定量PCR实验进行关键靶点的验证。通过DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析。结果:体外细胞实验表明乳香挥发油可抑制ISO诱导的H9c2心肌细胞表面积增大、蛋白合成增加以及心脏肥大相关胚胎基因心房钠尿肽(ANP)、β-MHC mRNA表达上调。基于文献筛选乳香挥发油有效成分86种,抗心脏肥大靶点36个。网络分析雌激素受体1(ESR1)、内皮型一氧化氮合酶(NOS3)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、肿瘤坏死因子(TNF)、丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)是关键靶点,荧光定量PCR结果显示乳香挥发油抑制ISO诱导的心肌细胞ESR1、PTGS2、TNF、MAPK14 mRNA水平上调,NOS3、PPARG mRNA水平下调。GO功能富集分析主要涉及脂多糖介导的信号通路、一氧化氮生物合成过程的正调控、质膜穴样内陷、酶结合等。KEGG通路富集分析包含通路22条,主要与VEGF signaling pathway,TNF signaling pathway,Sphingolipid signaling pathway等相关。结论:乳香挥发油活性成分可能是通过作用于ESR1、NOS3、PTGS2、TNF、MAPK14、PPARG等关键靶点,调节VEGF signaling pathway,TNF signaling pathway,Sphingolipid signaling pathway等途径,影响脂多糖介导的信号通路、一氧化氮生物合成过程的正调控、质膜穴样内陷、酶结合等改善心脏肥大。

氧化前胡素对乳腺癌MCF-7/DOX细胞多柔比星耐药的抑制作用

目的:探讨氧化前胡素(oxypeucedanin,OPD)对人乳腺癌MCF-7/DOX细胞多柔比星耐药的影响并探究其可能机制。方法:体外培养MCF-7/DOX细胞,MTT法检测OPD对MCF-7/DOX细胞增殖的影响,并考察OPD最大无毒浓度与多柔比星不同浓度联用对MCF-7/DOX细胞增殖的影响。qRT-PCR检测OPD与多柔比星联用对MCF-7/DOX细胞MDR1、MRP1及甘油磷脂代谢酶AGPAT2、CHKA、CEPT1、DGKA、PCYT1A、PLA2G15 mRNA水平的影响。Western blot检测OPD与多柔比星联用对MCF-7/DOX细胞MDR1、MRP1、CHKA及CCTα蛋白表达的影响。结果:OPD 50μg/mL与多柔比星联用作用于MCF-7/DOX细胞的IC_(50)值低于多柔比星单独,其逆转倍数为1.56倍。与对照组比较,多柔比星组MCF-7/DOX细胞MDR1、MRP1和6种甘油磷脂代谢酶mRNA均下调(P<0.05或P<0.01),MDR1、MRP1、CHKA和CCTα蛋白表达无显著变化(P>0.05),OPD 50μg/mL与多柔比星联用组上述基因和蛋白表达均显著下调(P<0.05)。与多柔比星组比较,OPD 50μg/mL与多柔比星联用组MCF-7/DOX细胞上述基因表达进一步下调(P<0.05或P<0.01),上述4种蛋白表达无显著变化(P>0.05)。结论:OPD可增强MCF-7/DOX细胞对多柔比星的化疗敏感性,逆转耐药,可能与其抑制甘油磷脂代谢途径有关。

胆固醇酯转运蛋白在家兔心脏肥大中表达的实验研究

目的复制异丙肾上腺素致家兔心脏肥大模型,考察胆固醇酯转运蛋白(CETP)的表达变化。方法将雄性新西兰兔随机分为正常组和模型组。模型组采用腹腔注射异丙肾上腺素15 mg/(kg·d)(分早晚2次进行)建立家兔心脏肥大模型,正常组腹腔注射等体积的生理盐水,连续14 d后,取血、心脏和肺脏,分离左、右心室,考察脏器指数;HE染色观察心肌组织形态学改变;RT-PCR法检测心脏肥大相关胚胎基因ANP、β-MHC mRNA表达;检测血清TG、TC、LDL-C及HDL-C的含量;检测左心室CETP的mRNA水平、蛋白表达及含量。结果与正常组比较,模型组家兔心脏质量指数(HW/BW)和左心室质量指数(LVW/BW)显著增加(P<0.05),右心室质量指数(RVW/BW)和肺脏质量指数(LW/BW)有增加的趋势,左心室心肌细胞体积明显增大,间质增宽,左心室ANP、β-MHC的mRNA表达显著上调(P<0.05)。与正常组比较,模型组家兔血清TG含量显著升高(P<0.05),TC、LDLC水平呈升高趋势,HDL-C水平呈下降趋势,模型组家兔左心室组织中CETP mRNA水平和蛋白表达均显著上调(P<0.05),CETP含量显著增加(P<0.05)。结论在异丙肾上腺素诱导的家兔心脏肥大模型中,CETP表达上调,但其是否与心脏肥大有关还有待进一步深入研究。本研究结果为后续研究CETP与心脏肥大的关系提供了理想动物模型。

薯蓣皂苷对异丙肾上腺素诱导H9c2心肌细胞肥大的保护作用

目的:探究薯蓣皂苷对异丙肾上腺素诱导的大鼠H9c2心肌细胞肥大的保护作用及潜在作用机制。方法:采用MTT法筛选异丙肾上腺素和薯蓣皂苷的安全浓度范围,明确异丙肾上腺素诱导心肌细胞肥大的最佳造模浓度,确定薯蓣皂苷作用于心肌细胞的最大无毒浓度。将心肌细胞分为空白对照组、模型对照(异丙肾上腺素)组、异丙肾上腺素+薯蓣皂苷1.25μg/mL组、薯蓣皂苷1.25μg/mL组,通过细胞拍照结合Image J软件测量心肌细胞面积,qRT-PCR法检测心肌肥大相关胚胎基因Anp、β-mhc、α-ska表达,进一步采用qRT-PCR、Western blot检测心肌细胞甘油磷脂代谢酶Dgkz和Pla2g6 mRNA和蛋白表达。结果:异丙肾上腺素在2.5μmol/L~40μmol/L范围对心肌细胞增殖没有明显影响,选取异丙肾上腺素10μmol/L诱导心肌细胞肥大。薯蓣皂苷作用于心肌细胞的最大无毒浓度为1.25μg/mL。与空白对照组比较,模型对照组心肌细胞面积明显增加,Anp、β-mhc、α-ska表达上调,Dgkz和Pla2g6 mRNA及其蛋白表达明显上调(P<0.05);与模型对照组比较,异丙肾上腺素+薯蓣皂苷1.25μg/mL组心肌细胞面积降低,Anp、β-mhc、α-ska表达下调,Dgkz和Pla2g6 mRNA及其蛋白表达均明显下调(P<0.05)。结论:薯蓣皂苷抑制异丙肾上腺素诱导的心肌细胞肥大,可能与其抑制甘油磷脂代谢酶DGKZ和PLA2G6的表达有关。

苦瓜皂苷L对异丙肾上腺素诱导的大鼠H9c2心肌细胞肥大的作用研究

目的探究苦瓜皂苷L对异丙肾上腺素诱导的大鼠H9c2心肌细胞肥大的保护作用及机制。方法 (1)体外培养大鼠H9c2心肌细胞,采用MTT法评价不同浓度的异丙肾上腺素(0.625、1.25、2.5、5、10μmol·L-1)和不同浓度的苦瓜皂苷L(1.625、3.125、6.25、12.5、25.0μg·mL^(-1))对心肌细胞活力的影响。(2)采用异丙肾上腺素诱导心肌细胞肥大模型。实验分为正常组、模型组、苦瓜皂苷L干预组和苦瓜皂苷L单独组。分别通过细胞拍照结合ImageJ软件测量、荧光定量PCR法考察苦瓜皂苷L 12.5μg·mL^(-1)对异丙肾上腺素诱导的心肌细胞表面积和心肌肥大相关胚胎基因ANP、β-MHC及α-SKA表达的影响。在此基础上,选择参与甘油磷脂代谢的酶VI组磷脂酶A2(PLA2G6)、二酰甘油激酶ζ(DGKZ)、甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶1(GPCPD1)为指标,评价苦瓜皂苷L对异丙肾上腺素诱导的心肌细胞上述3种酶基因表达的影响;进一步以PLA2G6和DGKZ蛋白为指标,采用Western Blot法考察苦瓜皂苷L对异丙肾上腺素诱导的心肌细胞PLA2G6和DGKZ蛋白表达的影响。结果 (1)与正常组比较,异丙肾上腺素(0.625~10μmol·L-1)和苦瓜皂苷L(1.625~25μg·mL^(-1))对心肌细胞活力没有明显影响(P>0.05)。本研究选用异丙肾上腺素10μmol·L^(-1)和苦瓜皂苷L 12.5μg·mL^(-1)进行实验。(2)与正常组比较,模型组心肌细胞表面积增加(P<0.05),心肌肥大相关胚胎基因ANP、β-MHC、α-SKA表达上调(P<0.05),PLA2G6、DGKZ、GPCPD1 mRNA表达上调(P<0.05),PLA2G6和DGKZ蛋白表达增加(P<0.05);与模型组比较,苦瓜皂苷L干预组能够降低心肌细胞表面积(P<0.05),下调心肌肥大相关胚胎基因ANP、β-MHC、α-SKA表达(P<0.05),下调PLA2G6、DGKZ、GPCPD1 mRNA表达(P<0.05),降低PLA2G6和DGKZ蛋白表达(P<0.05)。结论苦瓜皂苷L可缓解异丙肾上腺素诱导的心肌细胞肥大,可能与其抑制甘油磷脂代谢酶PLA2G6和DGKZ的表达有关。

苦瓜素Ⅰ抑制乳腺癌MCF-7/DOX细胞多柔比星耐药的研究

目的:研究苦瓜素Ⅰ(momordicin Ⅰ,MMI)对人乳腺癌耐多柔比星(doxorubicin,DOX)MCF-7/DOX细胞耐药的影响及其作用机制。方法:MTT比色法检测MMI对MCF-7/DOX细胞的毒性,考察MMI对MCF-7/DOX细胞多柔比星敏感性的影响;实时定量PCR和western blot方法检测DOX单独以及MMI与DOX联用后,MCF-7/DOX细胞中MDR1在mRNA和蛋白质水平的表达变化;进一步采用实时定量PCR方法检测DOX单独以及MMI与DOX联用后,MCF-7/DOX细胞中与甘油磷脂代谢相关的AGPAT2、CEPT1、CHKA、DGKA、PCYT1A、PLA2G15等基因表达的变化。结果:MMI(12.5,25,50μg·mL^(-1),)可明显抑制MCF-7/DOX细胞的增殖,MMI对MCF-7/DOX细胞的最大无毒浓度为6.25μg·mL^(-1)。MMI 6.25μg·mL^(-1)与DOX联用后,DOX对MCF-7/DOX细胞的半数抑制浓度(IC50)下降,MMI使得MCF-7/DOX细胞对DOX的敏感性提高了13.88倍。与DOX 50μg·mL^(-1)单独组相比,MMI 6.25μg·mL^(-1)与DOX 50μg·mL^(-1)联用后,MCF-7/DOX细胞中的MDR1 mRNA显著下调(P<0.05),MDR1蛋白表达有下降趋势。进一步研究发现MMI 6.25μg·mL^(-1)与DOX 50μg·mL^(-1)联用可协同下调MCF-7/DOX细胞甘油磷脂代谢相关基因AGPAT2、CEPT1、CHKA、DGKA、PCYT1A、PLA2G15等表达。结论:MMI可增强乳腺癌MCF-7/DOX细胞多柔比星敏感性,抑制MDR1表达,逆转耐药,此作用可能与其抑制甘油磷脂代谢有关。