钙调蛋白的N末端和C末端片段载体构建和蛋白制备

目的构建钙调蛋白(Ca M)的N末端片段(N-lobe)、C末端片段(C-lobe)及其钙离子(Ca2+)结合位点突变体(N-lobe12,Clobe34)原核表达载体并进行蛋白表达、纯化和活性鉴定。方法将上述c DNA片段插入PGEX-6p-3质粒载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。利用Glutathione-Sepharose 4B beads进行分离纯化。采用SDS-PAGE检测目的蛋白纯度和相对分子质量,Bradford方法测定纯化后蛋白浓度,GST pull-down方法和膜片钳技术检测纯化后蛋白活性。结果蛋白高表达,纯化后获得高纯度、高浓度目的蛋白,纯化后蛋白能与Cav1.2型钙通道结合并可恢复已"rundown"心肌细胞膜钙通道的活性。结论本研究成功构建可以表达生物活性蛋白的N-lobe、C-lobe、N-lobe12及C-lobe34原核表达载体,为深入研究Ca M的生物学功能奠定了基础。

体外重组CaV1.2不同蛋白片段纯化及其与CaM相互作用的研究

目的纯化CaV1.2不同蛋白片段并研究其与CaM的相互作用。方法质粒转化、筛选得到转化成功BL21菌株,利用IPTG诱导GST钙通道融合蛋白表达,Glutathione-Sepharose 4B beads纯化钙通道不同蛋白片段;采用GST pull-down assay实验研究钙通道蛋白不同片段与CaM以及突变体的相互作用。结果 SDS-PAGE结果显示成功纯化获得钙通道不同蛋白片段;GST pull-down assay结果显示CT1可与CaM及突变体结合,且GST-CT1与野生型CaM结合量显著多于与突变体CaM结合量。结论成功纯化CaV1.2钙通道蛋白片段并顺利完成GST pull-down assay实验,为深入研究蛋白相互作用或发现新的蛋白相互作用奠定了基础。

重组钙调蛋白及其突变体蛋白的分离纯化及活性鉴定

目的建立一种简单稳定高效分离纯化体外重组钙调蛋白(CaM)及其突变体蛋白的方法。方法将CaM及其三种钙结合位点突变体的cDNA插入pGEX-6p-3质粒载体后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,大量培养并利用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导CaM及其突变体的GST融合蛋白表达,GS-4B beads进行分离纯化。采用SDS-PAGE检测目的蛋白纯度和相对分子质量;采用Bradford方法测定纯化后蛋白浓度;采用膜片钳技术检测纯化后蛋白的活性。结果纯化的CaM及突变体蛋白具有较高的纯度;CaM及突变体蛋白得到了大量表达;纯化后蛋白可恢复已"run-down"心肌细胞膜钙通道的活性。结论本研究成功建立了一种稳定高效简单的重组CaM及其突变体蛋白的分离纯化方法,为深入研究CaM的生物学功能奠定了基础。

钙调蛋白镁结合位点突变体载体的构建、表达纯化及鉴定

目的构建钙调蛋白3种镁离子结合位点突变体的质粒载体,并进行表达纯化及鉴定,为深入研究钙调蛋白的生物学功能奠定基础。方法利用钙调蛋白cDNA进行点突变,制备3种镁离子结合位点突变的cDNA。将突变后的cDNA分别插入pGEX-6P-3载体,制备钙调蛋白突变体载体质粒。质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,培养大肠杆菌,并诱导GST融合蛋白表达。利用Glutathione-Sepharose 4B珠子和PreScission蛋白酶分离纯化蛋白。结果酶切鉴定和DNA测序证实成功构建钙调蛋白突变体质粒;表达纯化得到的钙调蛋白突变体经电泳图鉴定纯度较高,浓度约1.0mg/mL。结论本研究成功构建了钙调蛋白镁结合位点突变体融合蛋白原核表达质粒,分离纯化可获得较高浓度较高纯度的钙调蛋白突变体。

心肌Cav1.2钙通道NT片段的提取纯化及其与CaM的相互作用

目的探讨心肌Cav1.2钙通道NT蛋白片段提取与纯化的方法,并研究其与CaM的相互作用。方法将NT的cDNA插入pGEX-6p-3质粒载体后,转化大肠杆菌BL-21感受态细胞,大量培养并利用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导NT的GST融合蛋白表达,GS-4B beads分离纯化,Pre Scission蛋白酶切除GST标签,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDSPAGE)检测蛋白纯度和相对分子质量。采用GST pull-down实验研究NT片段与Ca M的相互作用。结果 SDS-PAGE结果显示成功纯化获得NT蛋白片段,且具有较高的纯度。GST pull-down实验结果显示NT可与Ca M结合,且具有浓度依赖性。结论本研究成功制备与纯化了心肌Cav1.2钙通道NT蛋白片段,为深入研究蛋白相互作用及NT的生物学功能奠定了基础。

ACE2与新型冠状病毒肺炎的心肾损伤

由新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染引起的新型冠状病毒肺炎(Coronavirus disease 2019,COVID-19)不仅可以诱发典型的呼吸系统疾病,也能导致心肾系统等相关疾病。SARS-CoV-2的受体为血管紧张素转换酶2(Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)。本文通过阐述ACE2在心脏和肾脏中的作用,分析SARS-CoV-2感染引起患者心肾损伤的可能机制,为临床治疗COVID-19及研发抗SARS-CoV-2药物提供参考依据。

不锈钢在海水中腐蚀特性研究进展

不锈钢因具有优良的抗氧化、耐腐蚀等特性被广泛地应用于工业生产中。但是,不锈钢材料在海洋环境中容易受到海水的影响而降低其耐腐蚀特性。分析了不锈钢在海水中的腐蚀机理,并从溶解氧浓度、海水pH、海水流速、微生物等角度讨论了影响不锈钢在海水中腐蚀的因素,探讨了当前不锈钢防腐技术的研究情况。

海水环境中Cl^-浓度对316L不锈钢腐蚀行为的影响

为了探明Cl^-浓度对海水环境下金属材料的腐蚀影响,通过极化曲线、交流阻抗和循环伏安曲线,并结合Mott-Schottky曲线,分析了在不同Cl^-浓度的海水模拟溶液中316L不锈钢的电化学腐蚀行为。结果表明:在海水环境中,高浓度的Cl^-环境会使316L不锈钢试件的容抗弧直径减小,腐蚀电位下降,抗腐蚀能力变弱;在高Cl^-浓度下,不锈钢表面钝化膜更易破裂,且钝化膜的自我修复能力受到抑制; Cl^-浓度越大,空间电荷层厚度减少变化趋势越快,钝化膜腐蚀溶解的速率越快,316L不锈钢发生腐蚀的概率越大。

锅炉烟气脱硫除尘技术与DDNP废水治理技术结合应用与研究

通过对宁夏天长民爆器材有限责任公司的锅炉烟气脱硫除尘技术与炸药废水治理技术综合应用研究,系统的介绍了锅炉烟气脱硫除尘技术与炸药废水治理技术综合应用于化工场所的成功环保经验,可以做到工业生产废气、废水和废料零排放,可供相似化工生产条件下的环保治理借鉴。

CaM突变体质粒的构建、表达纯化及活性鉴定

目的制备钙调蛋白(CaM)突变体CaM_(E141G)的融合蛋白质粒,并进行蛋白表达、提取纯化和活性鉴定。方法利用定点突变技术将野生型CaM的第141个氨基酸E(GAG)突变为G(GGG),再将突变体质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,大量培养后诱导其GST融合蛋白表达,GS-4B beads纯化,Pre Scission protease酶切GST标签,采用Bradford方法测定纯化后蛋白浓度,SDS-PAGE凝胶电泳检测CaM_(E141G)蛋白的相对分子量和纯度,pull-down实验鉴定纯化后蛋白的生物活性。结果提取纯化后的CaM_(E141G)蛋白具有较高的浓度和纯度,且能与心肌CaV1.2钙通道C末端的PreIQ蛋白片段结合,并具有CaM_(E141G)蛋白浓度依赖性,提示该蛋白具有与心肌CaV1.2钙通道结合的能力。结论成功构建了CaM_(E141G)融合蛋白质粒,并获得了纯化后的CaM_(E141G)蛋白,为深入研究CaM突变体在心肌CaV1.2钙通道中的调节作用及其与心血管系统疾病的关系奠定了基础。

创新创业知识对临床药学学生能力培养初探

大学生创新与创业教育是高等学校的重要任务之一。临床药学专业是近年来新兴的一门专业。在大众创业、万众创新的经济时代背景下,对临床药学专业学生进行创新与创业能力培养势在必行。通过对药物毒理学授课加入创新与创业知识,提高了学生对创新与创业的认知度,影响学生的长期学习规划,使学生更早更好地为将来的就业做好充分的准备。文章对创新创业知识对临床药学学生能力培养进行初步的探索研究,为培养创新型医药兼修人才打下坚实的基础。

场景PBL教学方法在药物毒理学中的应用

PBL结合场景教学方法首次应用于药物毒理学课程教学。108名学生随机分为场景PBL组和传统PBL组,采用问卷调查评估教育环境和教学效果。结果显示,与传统PBL教学相比,场景PBL组学生认为教育环境得到进一步改善,学习主动性和综合学习能力得到进一步提高。因此,场景PBL教学方法能显著改善教育环境、提高教学效果。

Na_(V)1.5钠通道C末端IQ基序的重组质粒构建及蛋白制备

目的构建Na_(V)1.5钠通道C末端IQ基序原核表达载体并进行蛋白表达、纯化和生物学鉴定。方法将IQ基序的cDNA片段插入pGEX-6P-3质粒载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,Glutathione-Sepharos 4B分离纯化后采用SDS-PAGE检测目的蛋白纯度和相对分子质量,pull-down方法检测GST-IQ融合蛋白的生物学活性。结果构建的IQ重组质粒经限制性内切酶和基因测序双重鉴定显示质粒构建成功,融合蛋白经纯化后其浓度和纯度均较高,并具有能够与CSL蛋白浓度依赖性结合的生物学活性。结论本研究成功构建了可以表达生物活性蛋白的NaV1.5钠通道IQ基序原核表达载体,为深入探讨NaV1.5钠通道的生物学功能奠定了重要的物质基础。

钙调蛋白结构域来源小分子多肽的构建

目的构建钙调蛋白结构域来源小分子多肽(EF-hand 4,a.a 113-148),建立一种简便、直观、快速检测EF-hand 4的电泳方法。方法通过固相合成法构建EF-hand 4。采用分离胶为16.5%T的Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳法检测多肽,CS Analyzer 3.0软件对EF-hand 4多肽条带进行纯度分析,GST pull-down方法检测EF-hand 4的生物学活性。结果Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,在约4×10^(3)处可见EF-hand 4清晰蛋白条带;CS Analyzer 3.0软件分析其纯度为100%;GST pull-down结果表明,EF-hand 4可以和CaV1.2钙通道结合,具有生物学活性。结论Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳法可简便、直观、快速检测EF-hand 4,固相合成法得到的EF-hand 4具有与钙通道结合的生物学活性,本研究为CaM结构域来源EF-hand 4生物学功能的深入研究提供了材料基础。

超声破碎法联合应用DTT提取纯化Ca_V1.2钙通道CT3蛋白

目的探讨心肌Ca_V1.2钙通道CT3蛋白片段提取与纯化的方法。方法将CT3的cDNA插入pG EX-6p-3质粒载体后,转化大肠杆菌BL-21感受态细胞,大量培养并利用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导CT3的GST融合蛋白表达,并采用超声破碎法进行分离纯化,在10mmol/L二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol,DTT)存在的情况下,PreScission蛋白酶切除GST标签,凝胶电泳鉴定CT3蛋白,检测蛋白纯度和相对分子质量。结果 SDSPAGE结果显示,超声破碎法可以纯化得到GST-CT3融合蛋白,且单纯应用PreScission蛋白酶酶切GST-CT3,得到的CT3蛋白片段浓度较低,而采用PreS cission蛋白酶联合应用DTT则可以成功提取纯化出浓度较高的CT3蛋白片段。结论超声破碎法联合应用DTT与PreScission蛋白酶能够提取纯化出高浓度和纯度的CT3蛋白片段,为深入研究CT3的生物学功能奠定了基础。

CSL与CaV 1.2钙通道N末端的相互结合作用

目的探讨钙蛋白酶抑素结构域L(CSL)与CaV1.2钙通道N末端(NT)之间的相互结合作用。方法利用I-TASSER同源建模服务器,对豚鼠CaV 1.2钙通道N末端和人源CSL蛋白进行同源建模,利用MOE软件预测CSL和NT蛋白之间的结合,并采用GST pull-down实验研究CSL和NT蛋白的结合特点。结果与MOE软件预测出CSL和NT蛋白可以结合,且在NT蛋白上存在两个结合位点;Pull-down实验进一步证实二者可以直接结合,且该结合具有CSL浓度依赖性。结论 CSL可以与NT蛋白结合,为进一步揭示CaV1.2钙通道的调节机制奠定了基础。

体外重组Ca_V1.2钙通道CT1蛋白片段制备方法的优化

目的通过改变多种实验条件提高CaV 1.2钙通道C末端GST融合蛋白(GST-CT1)在大肠杆菌BL21中的表达量及分离纯化产量。方法把pGEX-6p-3/CT1质粒转入大肠杆菌BL21中,筛选其中转化成功的菌株培养并用异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-Thiogalactoside,IPTG)在不同细菌浓度,不同诱导时间或不同温度下诱导表达GST-CT1蛋白,Glutathione-Sepharose 4B beads(GS-4B beads)纯化蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白表达水平。结果当吸光度为0.6~1.0时,GST-CT1在大肠杆菌BL21中的表达量较高,IPTG诱导表达蛋白大于4h后无明显表达量差异,并且当诱导温度为25℃时,蛋白的产量将大大增加。结论可以通过控制细菌数量、控制诱导时长和降低诱导温度的方法来提高GST-CT1蛋白的产量。