滑液囊支原体与鸡传染性支气管炎病毒共感染对SPF鸡的致病性研究

为比较滑液囊支原体(MS)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)共感染对SPF鸡的致病性,本研究将144只28日龄SPF鸡随机均分为阴性对照组、MS感染组、IBV-M41感染组、IBV-M41+MS共感染组、IBV-QX感染组、IBV-QX+MS共感染组共6组,采用50μL/只剂量按相应分组点眼感染MS (106CCU50)、IBV(105EID50),阴性对照组以50μL/只点眼KM2培养基(左眼)和PBS (右眼)。感染后每天观察临床症状,在感染后7 d、14 d、21 d和28 d每组随机剖检6只鸡,观察气囊炎和气囊损伤评分,并采集气管进行病原再分离,其中MS经支原体液体培养基培养后进行PCR鉴定,IBV接种SPF鸡胚后进行RT-PCR鉴定。此外,各组鸡气管均经10%甲醛固定后进行粘膜厚度检测以及病理损伤评分。结果显示:除阴性对照组和MS感染组,其他组鸡在感染后4 d均出现一过性呼吸道症状。剖检结果显示MS感染组鸡在感染后21 d出现气囊炎,28 d仍可见气囊炎;而IBV-M41感染组和IBV-QX感染组鸡在感染后7 d或14 d出现气囊炎,且气囊炎的发生率均未超过50%。感染后14 d IBV-QX+MS共感染组鸡气囊炎发生率达100%(6/6),直至21 d并且大部分鸡气囊炎可持续至感染后28 d (5/6),而IBV-M41+MS共感染组鸡气囊炎仅可持续至感染后21 d,且气囊炎的发生率最高在感染后14 d (5/6)。IBV-QX+MS共感染组鸡平均气囊损伤评分在感染后14 d、21d和28 d均极显著高于单一感染组(P<0.001),而IBV-M41+MS共感染组鸡仅在感染后14 d极显著高于单一感染组(P<0.001)。病原再分离结果显示,各感染组鸡均在气管中再分离到MS(感染后28 d内)或IBV(感染后7 d内)。病理损伤检测结果显示,共感染组鸡较各单一感染组鸡气管粘膜增厚持续时间更长以及病理损伤更为严重。IBV-M41+MS共感染组鸡在感染后14 d平均气管粘膜厚度显著低于IBV-QX+MS共感染组(P<0.05),而在感染后21 d极显著低于IBV-QX+MS共感染组(P<0.001),其余各组鸡在感染后14 d和21 d均极显著低于IBV-QX+MS共感染组鸡(P<0.001)。IBV M41+MS共感染组鸡最早14 d出现气管病变,而IBV QX+MS共感染组鸡在共感染后7 d就可见气管病理损伤,且共感染组鸡的平均气管损伤评分均极显著高于单一MS或IBV感染组(P<0.01或P<0.001)。上述结果证实MS和IBV共感染较单一感染对28日龄SPF鸡的致病性更强,IBV M41或QX株与MS共感染对SPF鸡的致病性存在差异,本研究为临床IB和MS的防控提供科学参考依据。

基于黏膜sIgA抗体的非洲猪瘟病毒感染早期血清学检测方法的建立

目前的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学检测方法存在因采血引起交叉感染风险、抗体转阳滞后影响检测敏感性等问题,因此建立一种无创采样且可实现早期诊断的血清学方法对于在临床上ASFV感染的诊断与监测有重要意义。本研究以人工合成的方式构建了pFastbac1-P30-His重组表达载体,利用杆状病毒-昆虫细胞真核表达系统表达ASFV重组P30蛋白(SUMO-P30),用Ni柱亲和纯化后作为包被抗原,经过一系列条件优化,建立一种以猪口腔液中黏膜sIgA抗体为靶标的ASFV抗体间接ELISA方法。结果显示,真核重组表达的P30蛋白(SUMO-P30)约为47 ku,Western blot鉴定显示其具有良好的反应原性;经优化确定了ELISA最佳反应条件:包被量为1.0μg·mL^(-1),5%脱脂乳为最佳样品稀释液,与待检口腔液的最佳混合比例为2∶8,样品反应时间为120 min,鼠抗猪IgA-HRP最佳稀释度为1∶5000,反应时间为60 min,最佳显色时间为15 min。该方法检测ASFV感染口腔液抗体效价可达1∶32,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒黏膜抗体阳性口腔液均无交叉反应,具有良好的敏感性和特异性。利用该方法和ASFV商品化ELISA血清抗体检测试剂盒,分别检测感染ASFV强毒株或人工致弱株后同一头猪不同时间点的口腔液和血清样品,口腔液中黏膜sIgA抗体在感染后3~5 d S/P值就显著提升,而血清抗体在监测期内未检测到转阳。检测人工感染或同圈感染自然变异株后不同时间点的口腔液和血清样品,本研究建立的方法与商品化非洲猪瘟病毒血清抗体检测试剂盒检测的阳性符合率为100%,阴性符合率为37.5%,总符合率为61.5%。综上,本研究建立了一种无需采血,以口腔液为样品的ASFV黏膜sIgA抗体ELSIA检测方法,可实现ASFV感染的无创、早期、敏感诊断,为ASFV的监测和防控提供新的技术支持和补充。

猪肺炎支原体LAP的结构预测及其抑制剂Bestatin对支原体生长的影响

本研究旨在以猪肺炎支原体为代表,研究支原体LAP酶活中心的高级结构及其被抑制后对支原生长的影响。亮氨酸氨肽酶(LAP)是一类广泛存在于各类生物的氨基酸代谢酶,有研究表明病原微生物的LAP酶活中心被抑制后可以直接影响微生物的代谢和生长。本研究拟以猪肺炎支原体(Mhp)LAP为模型,研究其理化特性和高级结构,探索LAP抑制剂乌苯美司(Bestatin)对支原体生长的影响。本研究首先用Clustal Omega进行序列同源性比较,分析LAP活性位点在不同支原体中的保守情况。然后采用GST融合标签表达猪肺炎支原体LAP蛋白,通过GST亲和层析和分子筛层析纯化蛋白,圆二色谱测定LAP的二级结构,用Alpha fold 2预测三级结构。最后用Bestatin与猪、鸡、羊等不同种属的支原体共培养来观察其影响。结果表明虽然总体序列同源性不高,但是LAP酶活中心的关键位点在常见支原体相对保守。猪肺炎支原体LAP可以通过GST标签进行可溶性表达。酶切GST标签后,分子筛层析显示LAP是六聚体,圆二色谱表明LAP具有正确的二级结构。预测的LAP三级结构显示其具有保守的底物结合关键位点。Bestatin对不同种属支原体的生长均产生抑制,且呈现剂量依赖性,但在不同菌株间存在差异,最低在6μg/mL的浓度可通过抑制氨肽酶的活性抑制猪肺炎支原体的生长。该研究为新一代抗菌药物的研发提供了新的思路。

我国实验用猪的健康管理与应用前景

猪在生理生化指标、解剖结构、系统功能、营养代谢以及疾病发生和发展等方面与人类机体相对应的系统和功能相类似。目前人医和动物医学领域各项研究中,越来越多研究者首选使用猪进行科学试验。本文将着重讨论我国当下实验用猪猪群的健康管理,包括实验用猪猪群生物安全体系建立、生产管理、疫病监测机制、药物保健等,以提升实验用猪在饲养繁育和管理过程中的微生物等级与健康管理水平,减少其在实验过程中对科学实验造成的干扰。

猪腹膜间皮细胞的分离培养及初步应用

本研究旨在建立猪原代腹膜间皮细胞(peritoneal mesothelial cell, PMC)的分离和体外培养方法,并将其初步应用于猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis,Mhr)体外感染细胞模型。采用0.1%Ⅰ型胶原酶消化猪大网膜组织分离猪PMC细胞,通过形态学、免疫学方法鉴定细胞。使用Mhr感染PMC细胞,观察细胞形态变化,并利用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)法检测细胞活性损伤情况。结果显示,倒置相差显微镜观察显示,分离培养的细胞早期呈拉网状,5~8 d后生长可达融合状态,细胞大小均一,呈多边形铺路石状;间接免疫荧光试验结果显示,细胞波形蛋白、角蛋白-18抗原呈阳性,第Ⅷ因子相关抗原、白细胞CD45抗原呈阴性;扫描电镜下可见细胞表面微绒毛。结果证实分离培养的细胞为猪PMC细胞,纯度达95%以上。Mhr感染后,光镜下可观察到细胞发生明显皱缩,感染组细胞的LDH释放量较对照组细胞显著升高。本研究成功建立了猪原代PMC细胞的分离培养方法,并初步用于Mhr体外感染,为研究Mhr等引起浆膜炎的病原与宿主的互作机制提供了体外细胞模型。

猪肺炎支原体乳酸脱氢酶在诱导猪支气管上皮细胞凋亡中的作用

猪肺炎支原体感染会引起宿主上皮细胞的损伤及凋亡。上皮屏障的破坏往往导致细菌和病毒的继发感染,给养猪业造成严重的经济损失,但具体的致病机制及毒力因子尚未完全阐明。前期研究发现猪肺炎支原体乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)不仅参与猪肺炎支原体的代谢还与猪肺炎支原体的毒力相关。因此,本研究通过原核表达及亲和层析获得猪肺炎支原体乳酸脱氢酶重组蛋白(recombinant LDH, rLDH),之后分别用不同浓度的rLDH与猪支气管上皮细胞(porcine bronchial epithelial cell, PBEC)孵育,经显微镜观察rLDH对细胞形态的影响,通过CCK-8法检测rLDH对细胞活力的影响。选取对细胞形态及活力影响不显著的50和100μg·mL^(-1) rLDH分别与PBEC孵育,通过流式细胞仪检测细胞凋亡率,反转录荧光定量PCR(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)法和免疫印记检测凋亡相关基因caspase 3、caspase 8、caspase 9、Bax、BCL-2的转录水平和蛋白水平。结果显示:猪肺炎支原体rLDH呈剂量依赖性地诱导PBEC凋亡,其作用与猪肺炎支原体菌株一致。用rLDH及Mhp 168孵育后,PBEC的促凋亡因子Bax、caspase 3和caspase 9的mRNA水平显著上调,凋亡抑制因子BCL-2的mRNA水平显著下调,caspase 8的mRNA水平未发生显著变化。促凋亡因子Bax、caspase 3的蛋白表达水平显著上调,凋亡抑制因子BCL-2的蛋白表达水平显著下调。结果表明,猪肺炎支原体可能通过LDH诱导PBEC内源性细胞凋亡,凋亡相关因子caspase 3、caspase 9、Bax和BCL-2在其中发挥重要作用。

猪支原体肺炎活疫苗与灭活疫苗联合免疫效果评价

为探寻一种更加合理高效的猪支原体肺炎(MPS)免疫方式,本研究使用MPS弱毒疫苗进行基础免疫后14 d再使用灭活疫苗进行加强免疫,通过人工感染猪肺炎支原体来评价其免疫效果。同时将这种免疫程序在规模化猪场进行应用,通过计算一定时期内的日增重来评价其免疫效果。结果显示:联合免疫在保证黏膜免疫效果的同时并未降低体液免疫水平;更为重要的是,联合免疫不但具备较高攻毒保护率,而且在攻毒后剖杀时其肺泡灌洗液中抗原含量远低于其他免疫方式。以上结果表明,联合免疫可以产生较好的免疫协同作用,从而提高了机体的综合免疫保护能力。田间试验结果发现:联合免疫组猪群从21日龄至80日龄平均增重27.31 kg,比活疫苗免疫组猪群多增重3.02 kg,比灭活疫苗免疫组猪群多增重3.73 kg;其平均日增重可达0.46 kg/d。本研究为防治猪支原体肺炎提供了新的思路。

不同种类呼吸道样品活体检测猪肺炎支原体抗原和抗体的比较分析

猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体(Mhp)引起的猪的一种慢性呼吸道疾病,Mhp基础感染率的监测对于及时实施控制措施和评估防控与净化效果至关重要。为了解在活体检测过程中的不同采集时间、样品类型和检测方法对猪肺炎支原体感染诊断结果的影响,本研究通过ELISA和实时定量PCR方法检测了来源于某大型养殖场的断奶仔猪、保育猪、屠宰猪、后备猪和种猪群活体采集的鼻拭子、喉拭子和咽拭子样品中的Mhp黏膜sIgA抗体和Mhp抗原。结果:鼻拭子、喉拭子和咽拭子样品总体的黏膜抗体阳性率分别为63.23%、62.55%和47.27%,抗原阳性率分别为74.75%、65.91%和63.64%。从不同的生产阶段看,保育猪和屠宰猪群中Mhp黏膜sIgA抗体阳性率较高,而断奶仔猪群中Mhp黏膜sIgA抗体阳性率最低。Mhp抗原的检出率随着猪群生产日龄的增加而增加,屠宰猪群和后备猪群鼻拭子和喉拭子中Mhp抗原阳性率达到峰值,种猪群中的抗原检测率出现了下降。对于鼻拭子样品中抗原与抗体的检测,从断奶仔猪至屠宰猪阶段,Mhp黏膜sIgA抗体的检出率更高,而后备猪群的抗原检出率更高。研究表明,在临床生产实际中,对于Mhp感染的活体检测,相较于喉拭子和咽拭子样本,鼻拭子样品对不同生产阶段猪群均具有更好的采集便利性与检测适用性。为了提高检测敏感性与准确度,黏膜sIgA抗体检测更适用于保育及生长育肥猪群,而定量PCR检测抗原则更适用于育肥后期以及后备猪群。

博落回提取物和抗生素联合用药对蛋种鸡自然感染滑液囊支原体的治疗效果分析

旨在分析博落回提取物和抗生素联合用药对蛋种鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synovia,MS)自然感染病例的治疗效果。选取80只124日龄的海兰褐父母代蛋种鸡,随机分为博落回提取物组(G1)、无处理组(G2)、盐酸多西环素+博落回提取物组(G3)、林可-大观霉素+博落回提取物组(G4)、酒石酸泰乐菌素+博落回提取物组(G5)、酒石酸泰万菌素+博落回提取物组(G6)、磷酸替米考星+博落回提取物组(G7)、延胡索酸泰妙菌素+博落回提取物组(G8)。G2组正常饮食和饮水,其余各组饲料中全程添加博落回提取物,此外G3~G8组通过饮水进行抗生素给药,连续使用5 d,停3 d后,再使用5 d。各组在用药前以及用药后第17天、第24天、第38天和第59天分别采集上颚裂拭子,并在用药后第59天采集输卵管膨大部和子宫部拭子进行MS病原荧光定量PCR检测。各组在用药前以及用药后第17天、第31天和第59天分别采血进行MS抗体检测。在用药后第59天剖检观察并统计包括气囊炎、脚垫肿胀和输卵管炎的发病率,同时采集气管、输卵管膨大部和子宫部固定并进行病理损伤观察。开产后,统计6周的周日均产蛋数,并测定各组第4、5和6周的蛋品质。结果显示:1)MS病原检测结果表明:用药后第17天和第24天,G4组的上颚裂拭子MS载量相较于G2组分别极显著和显著下降(P<0.001和P<0.01),用药后第17天,G6和G7组的上颚裂拭子MS载量相较于G2组显著下降(P<0.01);在用药后第17天和第24天,用药组上颚裂拭子的MS病原阳性率(G3和G5组除外)均下降,在用药后第59天,用药组(G4、G6和G8组除外)阳性率都恢复到用药前水平;G2和G8组的输卵管膨大部中MS病原阳性率为20%,G4、G5和G7组的阳性率均为10%,而G1、G3和G6组的输卵管膨大部以及各组子宫部均未检测到MS病原。2)MS抗体检测结果表明:G1和G4组用药后第59天抗体平均滴度较用药前下降60%左右。3)病理损伤观察发现:各组鸡用药前后气管均表现为不同程度的炎性细胞浸润,输卵管未发现任何病理损伤。4)蛋品质测定结果表明:G1、G3、G4和G6组开产后的周日均产蛋量都较G2组高;G8组开产后第4周的平均蛋重显著低于G2组(P<0.01),其余各组均未发现有显著差异;G4组在产蛋后第6周的中蛋(53<n≤63g)比率(60%)较其他组更高。综上,为了治疗蛋种鸡的MS自然感染,开产前采用博落回提取物或者博落回提取物联合抗生素,且开产后持续添加博落回提取物可降低上颚裂拭子的病原载量和阳性率,以及血清MS抗体平均滴度,同时周日均产蛋数明显增加,此外抗生素和博落回提取物联用还可提高中蛋的相对丰度。因此,本研究中的药物治疗方案可在一定程度上改善MS自然感染对蛋种鸡产蛋前期生产性能的影响。

猪支原体肺炎活疫苗经肌肉注射的免疫效果评价

猪支原体肺炎活疫苗(168株)是一种以肺内注射途径免疫的弱毒活疫苗。为了拓展猪支原体肺炎活疫苗的免疫途径,评估猪支原体肺炎活疫苗(168株)配合佐剂以肌肉注射方式免疫猪群后的攻毒保护效果,选取20头7日龄猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)阴性仔猪,将其随机平均分成4组,分别为健康对照组、感染对照组、肌肉注射免疫组和肺内注射免疫组。在免疫后采集血样并检测其中的Mhp IgG抗体,在首次免疫后42 d人工感染Mhp组织毒(JS株),攻毒28 d后评估肺脏的病变情况并测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中的Mhp含量。结果显示:免疫后肌肉注射免疫组动物产生了明显的Mhp特异性血清IgG抗体,而肺内注射免疫组动物在攻毒前未见明显的血清抗体;肌肉注射免疫组和肺内注射免疫组的攻毒保护率分别平均为88.89%和75.93%,且组间无显著性差异;感染对照组的BALF中Mhp单位含量极显著高于肌肉注射免疫组和肺内注射免疫组(P<0.01),2个免疫组间无显著性差异。结果表明:猪支原体活疫苗配合佐剂后经肌肉注射免疫可产生较好的免疫攻毒保护效果。本研究为猪支原体肺炎活疫苗(168株)实施肌肉注射免疫提供了临床数据支撑。

后非瘟时代猪场PRRSV类NADC30感染防控案例分析

猪繁殖与呼吸综合征一直是影响养猪业最严重的疾病,通过对1个PRRSV阴性猪场母猪突发大量流产的病例进行抗体和病原检测,细菌分离鉴定和MIC测定,然后制定和实施防控措施和评价指标。结果发现:(1)50份流产母猪PRRSV抗体检测阳性率100%;(2)母猪血清、流产物、睾丸去势液及保育猪组织样本,PRRSV阳性率分别为90.0%、80.0%、100.0%及85.7%,但所有样本CSFV、PRV、PPV及SIV病原均为阴性;(3)4份PRRSV阳性样本经ORF3、ORF5及Nsp2测序和比对,结果均与NADC30同源性最高;(4)保育猪组织样本分离到链球菌和副猪嗜血杆菌,MIC测定结果显示氟苯尼考和阿莫西林对上述2种分离菌最敏感;(5)控制措施实施后的3个月,母猪的流产率从发病期的43.6%,下降至3.6%,断奶7 d内配种率从发病期的63.3%上升至87.5%,哺乳仔猪和保育猪的死亡率分别从发病期的28.4%和38.8%下降至3.8%和4.7%。通过对该病例的诊断和疫情分析,采用灭活苗免疫接种和药物保健综合防控措施可快速取得效果,为规模化种猪场的PRRSV暴发防控提供参考。

基于串联亲和层析法纯化并鉴定猪初乳中SIgA

分泌型免疫球蛋白A(SIgA)是黏膜免疫的主要效应分子,在临床上常常作为疾病早期诊断的靶标,此外,基于SIgA的治疗性单抗和靶向SIgA产生的黏膜疫苗也越来越受到关注。分离并纯化出完整且具有活性的SIgA是产品研发的前提。为了提高猪初乳中SIgA的纯化效率,本研究采用串联亲和层析,强阴离子柱和精细分子筛层析进行纯化,从10 mL初乳中获得3 mg具有活性的SIgA。使用Western blot对纯化的SIgA进行鉴定,结果表明,纯化的SIgA与抗猪的重链蛋白单抗和抗SC单抗均具有良好的反应性。使用ELISA测试SIgA与抗猪的IgA重链单抗的反应性,结果发现使用本方法纯化的SIgA较原先方法(即硫酸铵沉淀,DEAE52弱阴离子层析,SephadexG-200凝胶层析和多次亲和层析的纯化方法)具有更高的反应性。最后使用质谱鉴定纯化的蛋白,结果表明为猪的SIgA。本研究为从猪初乳中纯化SIgA建立了一种高效的纯化方法,也为其它来源的SIgA的纯化提供参考。

鸡传染性喉气管炎病毒WF03株关键抗原基因和毒力基因的遗传演化与致病性分析

本研究旨在分析近年分离自鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)活疫苗免疫失败鸡群的ILTV WF03株的部分关键抗原基因及毒力基因的变异情况和对鸡的致病力,为ILTV活疫苗的有效性评价提供一个稳定、可靠的攻毒毒株。通过ILTV临床分离株WF03的部分免疫原性基因和毒力相关基因进行克隆和测序,并与疫苗株和早期分离株进行遗传进化分析,同时在28和56日龄SPF鸡测定了该毒株的致病力。遗传进化分析结果表明:WF03株主要免疫原性基因和毒力相关基因与我国早期的分离株和现在部分商品化的疫苗株处在同一个大的进化分支,亲缘关系较近。致病力试验显示WF03株以10^(4.5)、10^(4).0、10^(3.5)和10^(3.0)EID_(50)·羽^(-1)的剂量感染28日龄SPF鸡后发病率分别为100%、100%、95%和85%,死亡率分别为45%、30%、35%和10%;以10^(4).0 EID_(50)·羽^(-1)的剂量感染56日龄SPF鸡的发病率和死亡率分别为100%和27.3%;所有发病鸡临床症状主要表现为咳血、呼吸困难、张口呼吸等典型的喉气管炎发病症状。结果表明:ILTV临床分离株WF03主要抗原基因和毒力基因与我国早期分离株和疫苗株相比未发生明显变异,属于强致病力毒株,其对SPF鸡的发病能力稳定,在10^(4.5)、10^(4).0、10^(3.5)和10^(3.0)EID_(50)·羽^(-1)攻毒剂量时均可以使80%以上的鸡发病。结果提示目前我国鸡群中存在着强致病力ILTV毒株流行,且WF03株可以作为疫苗效力评价的攻毒毒株,这将丰富我国当前ILTV毒株的流行病学数据库。

自制ISCOMATRIX与CpG联合的HCA587蛋白疫苗的制备及其免疫效应评估

目的确定自制免疫刺激复合物(ISCOMATRIX)作为HCA587蛋白疫苗佐剂的有效剂量,并探讨其与CpG联合作为HCA587蛋白疫苗佐剂的免疫效力和肿瘤治疗效果。方法应用透析法将Quil A、胆固醇和磷脂制备成ISCOMATRIX,经磷钨酸负染并采用透射电子显微镜观察自制ISCOMATRIX的结构。建立小鼠免疫模型,将联合CpG的HCA587蛋白疫苗与不同剂量的自制ISCOMATRIX佐剂混合,经尾根部皮下免疫小鼠;采用酶联免疫斑点试验(ELISpot)检测产生IFN-γ的脾细胞频数,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清HCA587特异性抗体水平。在小鼠右侧胁腹部皮下接种B16-HCA587肿瘤细胞建立荷瘤小鼠模型,按照处理方式不同将小鼠分为HCA587蛋白疫苗治疗组(接种100μL包含CpG与最佳剂量的自制ISCOMATRIX的HCA587蛋白疫苗)与PBS对照组(注射100μL的无菌PBS),使用游标卡尺测量肿瘤大小。结果自制ISCOMATRIX佐剂呈典型的蜂窝状结构,直径20~30 nm,大小均一。12、36μg(QuilA浓度分别为0.012%、0.036%)的自制ISCOMATRIX组小鼠脾细胞分泌IFN-γ的频数与商品化ISCOMATRIX阳性对照组比较,差异无统计学意义(均P>0.05),且显著高于CpG+36μg ISCOM对照组与PBS组(均P<0.0001);5μg与18μg自制ISCOMATRIX组小鼠分泌IFN-γ的脾细胞频数,高于CpG+36μg ISCOM对照组与PBS组(均P<0.0001),但低于商品化ISCOM组(P=0.004)。12、18与36μg自制ISCOMATRIX组的血清HCA587抗体水平与商品化ISCOM阳性对照组比较,差异无统计学意义(均P>0.05);与PBS组相比,12μg自制ISCOMATRIX组1×10^(4)倍稀释血清的抗体滴度显著升高(P=0.0062)。与PBS对照组相比,HCA587蛋白疫苗治疗组肿瘤生长速度减缓,且第35天测量时肿瘤大小显著较小(P=0.0181)。结论以12μg自制ISCOMATRIX作为佐剂联合CpG制备的HCA587蛋白疫苗能诱导有效的免疫应答,并抑制荷瘤小鼠的肿瘤的生长,具有一定的肿瘤治疗作用。

弓形虫ITS-1序列PCR诊断方法的建立

目的本文旨在为弓形虫感染的临床病例检测建立特异性PCR诊断方法。方法本研究以弓形虫ITS-1序列为种特异性遗传标记,采用有限稀释法稀释速殖子DNA,经PCR扩增,检测该方法的敏感性;用同一引物扩增鸡柔嫩艾美耳球虫原虫和弓形虫,检测PCR方法的特异性。人工感染小鼠和家兔,用组织触片法和PCR方法检测感染动物的组织,并检测10头临床疑似病猪的肺脏、肺门淋巴结、脾脏、肾脏和肝脏等组织,比较两者的敏感性。结果该PCR方法最低可以检测1pg弓形虫速殖子DNA(相当于10个速殖子的DNA);鸡柔嫩艾美耳球虫原虫未扩增出特异条带,仅弓形虫出现特异条带(300bp)。组织触片和PCR方法对人工感染小鼠组织DNA的检出率均为87.5%(7/8),对人工感染家兔的检出率分别为50%(3/6)和66.7%(4/6),对临床疑似弓形虫病猪检测的阳性率均为20%,两种方法的检查结果基本一致。结论本试验结果表明,PCR技术可以作为弓形虫感染动物的诊断与检测方法。

猪肺炎支原体168弱毒株P46基因的克隆和鉴定

猪肺炎支原体的表面抗原基因 Ｐ４６基因可引起宿主早期特异性免疫反应，其分子量约４６ ｋ Ｄａ。根据 Ｇｅｎ Ｂａｎｋ 公布的 Ｐ４６基因序列设计１对能扩增 １ ３７７ ｂｐ Ｐ４６结构基因的引物（５： Ｇ Ｇ Ｃ Ａ Ａ Ｇ Ｃ Ｔ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ｇ Ｔ Ｔ Ｇ Ｔ Ｇ Ｇ Ａ Ｃ Ａ Ｇ Ａ Ｃ Ａ Ｇ，３： Ａ Ｃ Ｃ Ｇ Ｇ Ａ Ｔ Ｃ Ｃ Ａ Ｔ Ｃ Ａ Ｃ Ａ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ａ Ｇ Ｃ）作 Ｐ Ｃ Ｒ，成功地从猪肺炎支原体１６８弱毒株染色体 Ｄ Ｎ Ａ 中扩增出目的基因。 Ｐ Ｃ Ｒ 产物克隆于 ｐ Ｕ Ｃ１９质粒中，部分测序表明克隆基因与 Ｊ株基因同源性达９６％ 。其变异主要表现为 Ａ 碱基缺失或变为 Ｃ碱基；人工致弱株外显子基因中 Ａ、 Ｔ 碱基较 Ｇ、 Ｃ可能有更高的易变性。

鸡毒支原体人工发病封闭模型的建立

在透明塑料隔离器中，分别制造３０～１００ｍｇ／Ｌ的氨环境，观察其对ＳＰＦ“来杭鸡”的应激反应，结果氨浓度在８５ｍｇ／Ｌ以上时，鸡群发生严重伤害，而氨浓度在５０ｍｇ／Ｌ以下时则缺乏明显应激。氨环境作应激因素，对３０日龄无特定病原ＳＰＦ鸡以鸡毒支原体强毒株作人工发病，１２天后检查气囊病变，发病率为７５％（３／４）；以鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）、鸡传支病毒（ＩＢＶ）弱毒诱导，人工感染发病率为５０％（２／４）；经ＮＤＶ、ＩＢＶ弱毒诱导和７０ｍｇ／Ｌ的氨应激的联合作用，ＭＧ人工感染的致病率达１００％（７／７）。由此在隔离器内初步建立了鸡毒支原体人工发病的封闭模型。

南方夏季猪高热性疾病调查与回顾

2002年入夏以来，华东、华南每年夏初高温季节在大多养猪地区都会发生所谓的猪无名高热病，有明显的传染性，农村个体散养户和规模化猪场都有发生。2006年已造成猪百万头以上的损失，常规的抗菌和抗虫治疗几乎无效。对其致病原因，一直以来有各种诊断结果，但尚未能确定其病原。虽然疫情随着高温降低，已呈下降之势，但对周边地区仍构成侵袭。

猪气喘病实验猪模型的建立

目的研究建立猪气喘病人工发病模型。方法将分离得到的一株猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)Js株进行各种试验鉴定,证实其为Mhp强毒株。每头猪肺内接种Js株培养物2ml,15～25d后观察临床症状和病理变化,采集病变组织,经冻干制成攻毒用组织毒。安检合格,批号为20000324。给15头小梅山二元杂交猪分别气管内注射以KM_2培养基作10^(-2)、10^(-3)、10^(-4)和10^(-5)稀释的强毒,每头猪5ml,对照组注射培养基。攻毒后25d观察试验猪临诊症状,X线透视,记录病理变化。结果10^(-2)、10^(-3)、10^(-4)稀释的强毒试验组猪均出现了典型的猪气喘病临床症状和病理变化。结论人工发病试验测得Mhp Js株组织强毒接种气管内注射最小发病剂量为10^(-4)稀释5ml,正式试验人工发病可用100个最小发病剂量即强毒冻干物1:100稀释气管内注射5ml,可确保攻毒成功。

鸡败血霉形体SC克隆致弱株免疫原性试验

在透明塑料隔离器中进行了鸡败血霉形体人工发病试验，结果３０日龄ＳＰＦ来航鸡在ＮＤＶ、ＩＢＶ弱毒诱导和７０／１００００００（质量分数）氨环境刺激的联合作用下，致病率可达１００％（７／７）。经鸡败血霉形体Ｓ６克隆致弱株ＳＣＦ１５６代培养物点眼、滴鼻免疫后１０，２０，３０ｄ的ＳＰＦ来航鸡再以ＭＧ强毒攻毒，结果，保护率分别达８０．０％（４／５），７５．０％（３／４）和８７．５％（７／８）。近期免疫效果证明，鸡败血霉形体Ｓ６克隆致弱株ＳＣ有良好的免疫原性。