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重组谷氨酰胺转胺酶的表达、复性及纯化
被引量:
2
1
作者
邵坤彦
彭宝玉
+2 位作者
叶程
刘威
何冬兰
《华中农业大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2013年第1期14-18,共5页
以吸水链霉菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到谷氨酰胺转胺酶基因片段,构建pGEX-TGase重组质粒,并转化到大肠杆菌中得到重组菌BL21/pGEX-TGase。重组菌经乳糖诱导产生融合蛋白,并对诱导条件进行了优化。表达产物主要以包涵体形式存在,...
以吸水链霉菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到谷氨酰胺转胺酶基因片段,构建pGEX-TGase重组质粒,并转化到大肠杆菌中得到重组菌BL21/pGEX-TGase。重组菌经乳糖诱导产生融合蛋白,并对诱导条件进行了优化。表达产物主要以包涵体形式存在,采取稀释及尿素梯度液相色谱结合的方法,成功地实现了包涵体蛋白的复性。通过GST亲和柱纯化目的蛋白,得到酶活为29U/mg的电泳纯目的蛋白。
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关键词
谷氨酰胺转胺酶
乳糖诱导
包涵体蛋白
纯化
复性
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职称材料
利用RT-PCR快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒
被引量:
1
2
作者
邵坤彦
彭宝玉
+2 位作者
余金龙
张莹
何冬兰
《湖北植保》
2012年第4期20-23,共4页
根据黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)的外壳蛋白基因(CP基因)保守序列设计、合成引物,以感病西瓜、南瓜、玉米叶片组织总RNA为模板,进行cDNA合成和PCR扩增,并将扩增产物连接到pMD18-T载体上测序鉴定。核苷酸序列测定结果表明,此CP基因全...
根据黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)的外壳蛋白基因(CP基因)保守序列设计、合成引物,以感病西瓜、南瓜、玉米叶片组织总RNA为模板,进行cDNA合成和PCR扩增,并将扩增产物连接到pMD18-T载体上测序鉴定。核苷酸序列测定结果表明,此CP基因全长为654个核苷酸,与已报道的CGMMV的CP基因同源性为97%-100%。RT-PCR方法为检测CGMMV提供了操作更为简便、特异性更强的快速、准确的检测鉴定方法,是一种控制该潜在危险性有害生物蔓延的有效途径。
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关键词
黄瓜绿斑驳花叶病毒
RT-PCR
CP基因
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职称材料
一种快速提取质粒DNA鉴别重组克隆的方法
被引量:
2
3
作者
何冬兰
余金龙
+1 位作者
邵坤彦
邵洁云
《中南民族大学学报(自然科学版)》
CAS
2011年第1期37-38,共2页
依据快检缓冲液筛选重组子克隆的方法,结合碱裂解法提取质粒DNA的原理,经过试验摸索,应用了快检缓冲液直接裂解菌液,电泳后筛选重组质粒的方法,避免了提取质粒鉴定等繁琐步骤,其结果与菌液PCR、质粒酶切鉴定结果一致,可快速筛选出重组克隆.
关键词
碱裂解法
快检缓冲液
重组质粒
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职称材料
微生物谷氨酰胺转胺酶的乳糖诱导表达与纯化
被引量:
1
4
作者
何冬兰
邵坤彦
+2 位作者
叶程
黄俊
尚敏邦
《中南民族大学学报(自然科学版)》
CAS
2012年第3期26-32,共7页
对已构建的工程菌株pET22b-MTG/E.coli BL21(DE3)进行质粒酶切和PCR鉴定,优化诱导温度、时间、pH和乳糖浓度等反应条件,采用乳糖自诱导培养基培养重组菌.并将重组菌上清液经凝胶过滤,离子交换及镍柱亲和层析后,对谷氨酰胺转胺酶纯化和SD...
对已构建的工程菌株pET22b-MTG/E.coli BL21(DE3)进行质粒酶切和PCR鉴定,优化诱导温度、时间、pH和乳糖浓度等反应条件,采用乳糖自诱导培养基培养重组菌.并将重组菌上清液经凝胶过滤,离子交换及镍柱亲和层析后,对谷氨酰胺转胺酶纯化和SDS-PAGE电泳分析.结果表明:谷氨酰胺转胺酶在28℃,添加乳糖为1.2g/L诱导18 h,pH为7.0,培养11.5 h时升温至50℃诱导1 h,再放至28℃培养,表达效果较好,超过IPTG诱导效果.纯化后酶活为7.5 U/mL,比活力为10.9 U/mg.
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关键词
谷氨酰胺转胺酶
乳糖
表达
纯化
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职称材料
链霉菌H197 mtg基因毕赤酵母表达载体的构建与鉴定
5
作者
何冬兰
王亚南
+1 位作者
邵坤彦
叶程
《中南民族大学学报(自然科学版)》
CAS
2012年第1期30-33,共4页
将酵母胞内表达质粒pPIC3.5k重组成带有谷氨酰胺转胺酶的新型表达载体pPIC3.5k/MTG,为谷氨酰胺转胺酶(MTG)在毕赤酵母中的表达研究提供了实验基础.利用PCR的方法扩增出MTG基因片段,将目的片段和质粒pPIC3.5k进行双酶切后进行连接,构成...
将酵母胞内表达质粒pPIC3.5k重组成带有谷氨酰胺转胺酶的新型表达载体pPIC3.5k/MTG,为谷氨酰胺转胺酶(MTG)在毕赤酵母中的表达研究提供了实验基础.利用PCR的方法扩增出MTG基因片段,将目的片段和质粒pPIC3.5k进行双酶切后进行连接,构成重组质粒,然后转化至E.coli DH5α感受态细胞中,筛选阳性克隆,经测序证明为目的基因片段.结果表明:经过PCR和酶切均证明已经将目的片段转到酵母表达载体pPIC3.5k内.
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关键词
谷氨酰胺转胺酶
表达
载体
构建
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职称材料
重叠延伸PCR法定点突变微生物产谷氨酰胺转氨酶基因
被引量:
4
6
作者
叶程
邵坤彦
+3 位作者
王亚南
覃桂
代风娇
何冬兰
《中国生物制品学杂志》
CAS
CSCD
2013年第5期670-674,共5页
目的通过重叠延伸PCR法,定点突变微生物产谷氨酰胺转氨酶(Microbial transglutaminase,MTG)基因。方法根据GenBank中登录的Streptomyces sp.H197基因中MTG序列及重叠延伸PCR定点突变技术的原理,利用DNA-MAN5.0软件设计引物,以提取的Stre...
目的通过重叠延伸PCR法,定点突变微生物产谷氨酰胺转氨酶(Microbial transglutaminase,MTG)基因。方法根据GenBank中登录的Streptomyces sp.H197基因中MTG序列及重叠延伸PCR定点突变技术的原理,利用DNA-MAN5.0软件设计引物,以提取的Streptomyces sp.H197基因组DNA为模板,PCR扩增MTG基因,以扩增的MTG基因片段为模板,采用重叠延伸PCR技术对一个位点进行定点突变,胶回收PCR产物,与克隆载体pMD19-T连接后,转化感受态E.coli DH5α,提取质粒,经PCR及单、双酶切鉴定,并测序。结果重叠延伸PCR产物可见含有酶切位点和突变位点的特异性片段;重组质粒pMD19-T-MTG经PCR及单、双酶切鉴定,证明构建正确;测序结果表明,与野生型序列比对,仅有一个碱基发生改变,即第773位腺嘌呤突变为胞嘧啶,突变位点与预期一致,实现了目标位点的定点突变。结论重叠延伸PCR法对MTG基因序列预定位点突变成功,证明阳性克隆子含突变位点,为下阶段突变型功能表达奠定基础。
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关键词
谷氨酰胺转氨酶
重叠延伸聚合酶链反应
点突变
原文传递
题名
重组谷氨酰胺转胺酶的表达、复性及纯化
被引量:
2
1
作者
邵坤彦
彭宝玉
叶程
刘威
何冬兰
机构
中南民族大学生命科学学院
出处
《华中农业大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2013年第1期14-18,共5页
基金
湖北省自然科学基金项目(2010CDZ046)
文摘
以吸水链霉菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到谷氨酰胺转胺酶基因片段,构建pGEX-TGase重组质粒,并转化到大肠杆菌中得到重组菌BL21/pGEX-TGase。重组菌经乳糖诱导产生融合蛋白,并对诱导条件进行了优化。表达产物主要以包涵体形式存在,采取稀释及尿素梯度液相色谱结合的方法,成功地实现了包涵体蛋白的复性。通过GST亲和柱纯化目的蛋白,得到酶活为29U/mg的电泳纯目的蛋白。
关键词
谷氨酰胺转胺酶
乳糖诱导
包涵体蛋白
纯化
复性
Keywords
transglutaminase
lactose-induction
inclusion body protein
purification
renaturation
分类号
Q556 [生物学—生物化学]
下载PDF
职称材料
题名
利用RT-PCR快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒
被引量:
1
2
作者
邵坤彦
彭宝玉
余金龙
张莹
何冬兰
机构
中南民族大学生命科学学院
出处
《湖北植保》
2012年第4期20-23,共4页
基金
国家民委自然基金资助项目(PMZy02002)
文摘
根据黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)的外壳蛋白基因(CP基因)保守序列设计、合成引物,以感病西瓜、南瓜、玉米叶片组织总RNA为模板,进行cDNA合成和PCR扩增,并将扩增产物连接到pMD18-T载体上测序鉴定。核苷酸序列测定结果表明,此CP基因全长为654个核苷酸,与已报道的CGMMV的CP基因同源性为97%-100%。RT-PCR方法为检测CGMMV提供了操作更为简便、特异性更强的快速、准确的检测鉴定方法,是一种控制该潜在危险性有害生物蔓延的有效途径。
关键词
黄瓜绿斑驳花叶病毒
RT-PCR
CP基因
分类号
S436.421 [农业科学—农业昆虫与害虫防治]
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职称材料
题名
一种快速提取质粒DNA鉴别重组克隆的方法
被引量:
2
3
作者
何冬兰
余金龙
邵坤彦
邵洁云
机构
中南民族大学生命科学学院
出处
《中南民族大学学报(自然科学版)》
CAS
2011年第1期37-38,共2页
基金
国家民委自然基金资助项目(PMZY02002)
文摘
依据快检缓冲液筛选重组子克隆的方法,结合碱裂解法提取质粒DNA的原理,经过试验摸索,应用了快检缓冲液直接裂解菌液,电泳后筛选重组质粒的方法,避免了提取质粒鉴定等繁琐步骤,其结果与菌液PCR、质粒酶切鉴定结果一致,可快速筛选出重组克隆.
关键词
碱裂解法
快检缓冲液
重组质粒
Keywords
alkaline lysis
specific lysis buffer
recombination clones
分类号
Q753 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
微生物谷氨酰胺转胺酶的乳糖诱导表达与纯化
被引量:
1
4
作者
何冬兰
邵坤彦
叶程
黄俊
尚敏邦
机构
中南民族大学生命科学院生物工程实验室
出处
《中南民族大学学报(自然科学版)》
CAS
2012年第3期26-32,共7页
基金
湖北省自然科学基金资助项目(2010CDZ046)
文摘
对已构建的工程菌株pET22b-MTG/E.coli BL21(DE3)进行质粒酶切和PCR鉴定,优化诱导温度、时间、pH和乳糖浓度等反应条件,采用乳糖自诱导培养基培养重组菌.并将重组菌上清液经凝胶过滤,离子交换及镍柱亲和层析后,对谷氨酰胺转胺酶纯化和SDS-PAGE电泳分析.结果表明:谷氨酰胺转胺酶在28℃,添加乳糖为1.2g/L诱导18 h,pH为7.0,培养11.5 h时升温至50℃诱导1 h,再放至28℃培养,表达效果较好,超过IPTG诱导效果.纯化后酶活为7.5 U/mL,比活力为10.9 U/mg.
关键词
谷氨酰胺转胺酶
乳糖
表达
纯化
Keywords
transglutaminase
lactose
expression
purification
分类号
Q556 [生物学—生物化学]
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职称材料
题名
链霉菌H197 mtg基因毕赤酵母表达载体的构建与鉴定
5
作者
何冬兰
王亚南
邵坤彦
叶程
机构
中南民族大学生命科学学院
出处
《中南民族大学学报(自然科学版)》
CAS
2012年第1期30-33,共4页
基金
湖北省自然科学基金资助项目(2010CDZ046)
文摘
将酵母胞内表达质粒pPIC3.5k重组成带有谷氨酰胺转胺酶的新型表达载体pPIC3.5k/MTG,为谷氨酰胺转胺酶(MTG)在毕赤酵母中的表达研究提供了实验基础.利用PCR的方法扩增出MTG基因片段,将目的片段和质粒pPIC3.5k进行双酶切后进行连接,构成重组质粒,然后转化至E.coli DH5α感受态细胞中,筛选阳性克隆,经测序证明为目的基因片段.结果表明:经过PCR和酶切均证明已经将目的片段转到酵母表达载体pPIC3.5k内.
关键词
谷氨酰胺转胺酶
表达
载体
构建
Keywords
transglutaminase(MTG)
expression
vector
construction
分类号
Q556 [生物学—生物化学]
下载PDF
职称材料
题名
重叠延伸PCR法定点突变微生物产谷氨酰胺转氨酶基因
被引量:
4
6
作者
叶程
邵坤彦
王亚南
覃桂
代风娇
何冬兰
机构
中南民族大学生命科学学院
出处
《中国生物制品学杂志》
CAS
CSCD
2013年第5期670-674,共5页
基金
湖北省自然科学基金资助项目(2010CDZ046)
文摘
目的通过重叠延伸PCR法,定点突变微生物产谷氨酰胺转氨酶(Microbial transglutaminase,MTG)基因。方法根据GenBank中登录的Streptomyces sp.H197基因中MTG序列及重叠延伸PCR定点突变技术的原理,利用DNA-MAN5.0软件设计引物,以提取的Streptomyces sp.H197基因组DNA为模板,PCR扩增MTG基因,以扩增的MTG基因片段为模板,采用重叠延伸PCR技术对一个位点进行定点突变,胶回收PCR产物,与克隆载体pMD19-T连接后,转化感受态E.coli DH5α,提取质粒,经PCR及单、双酶切鉴定,并测序。结果重叠延伸PCR产物可见含有酶切位点和突变位点的特异性片段;重组质粒pMD19-T-MTG经PCR及单、双酶切鉴定,证明构建正确;测序结果表明,与野生型序列比对,仅有一个碱基发生改变,即第773位腺嘌呤突变为胞嘧啶,突变位点与预期一致,实现了目标位点的定点突变。结论重叠延伸PCR法对MTG基因序列预定位点突变成功,证明阳性克隆子含突变位点,为下阶段突变型功能表达奠定基础。
关键词
谷氨酰胺转氨酶
重叠延伸聚合酶链反应
点突变
Keywords
Microbial transglutaminase(MTG)
Overlap extension polymerase chain reaction
Site-directed mutagenesis
分类号
Q754 [生物学—分子生物学]
Q78 [生物学—分子生物学]
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题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
重组谷氨酰胺转胺酶的表达、复性及纯化
邵坤彦
彭宝玉
叶程
刘威
何冬兰
《华中农业大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2013
2
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职称材料
2
利用RT-PCR快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒
邵坤彦
彭宝玉
余金龙
张莹
何冬兰
《湖北植保》
2012
1
下载PDF
职称材料
3
一种快速提取质粒DNA鉴别重组克隆的方法
何冬兰
余金龙
邵坤彦
邵洁云
《中南民族大学学报(自然科学版)》
CAS
2011
2
下载PDF
职称材料
4
微生物谷氨酰胺转胺酶的乳糖诱导表达与纯化
何冬兰
邵坤彦
叶程
黄俊
尚敏邦
《中南民族大学学报(自然科学版)》
CAS
2012
1
下载PDF
职称材料
5
链霉菌H197 mtg基因毕赤酵母表达载体的构建与鉴定
何冬兰
王亚南
邵坤彦
叶程
《中南民族大学学报(自然科学版)》
CAS
2012
0
下载PDF
职称材料
6
重叠延伸PCR法定点突变微生物产谷氨酰胺转氨酶基因
叶程
邵坤彦
王亚南
覃桂
代风娇
何冬兰
《中国生物制品学杂志》
CAS
CSCD
2013
4
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