产黑普氏菌刺激原代人口腔角质细胞的时间序列基因表达谱研究

目的基于时间序列分析,研究产黑普氏菌(Prevotella melaninogenica,Pm)刺激原代人口腔角质形成细胞(primary human oral keratinocytes,pHOKs)后基因表达的时间趋势,以探究Pm与pHOKs相互作用的潜在机制。方法利用生物信息学方法分析pHOKs分别与Pm共培养4、24 h后的高通量测序结果,使用Mfuzz聚类算法将具有相似时间表达模式的基因划分聚类,并进行GO、KEGG以及STRING网络分析,进一步利用Cytoscape软件取交集得到枢纽基因(Hub基因)。采用实时荧光定量PCR检测Hub基因的表达。结果Pm刺激pHOKs 4、24 h分别有1456个和1386个差异表达基因。通过Mfuzz将其划分为3个聚类,其中簇1基因随时间延长其表达呈现下降的趋势,主要参与上皮细胞分化和上皮细胞向间充质细胞转化等生物学过程;簇2基因随时间延长其表达呈现上升的趋势,主要参与细菌感染、视黄醇代谢等过程;簇3基因表达在刺激前期上调、后期下调,主要参与细胞因子相关信号通路等过程。在PPI网络中筛选出簇1 Hub基因为VEGFA、GDNF;簇2中的Hub基因为PTGS2、ICAM1等;簇3中的Hub基因为IL-6、CCL2等。RT-qPCR检测结果显示,VEGFA、PTGS2、IFIT1、IRF1与测序数据中随着时间延长基因的表达趋势一致。结论本研究对Pm刺激pHOKs过程中相关生物学分子的动态模式进行了深度挖掘,发现与视黄醇代谢相关的基因以及负调控EMT的基因在OLP中异常表达,Pm入侵上皮细胞后可能通过一些适应性机制逃避免疫监视,该发现有助于进一步探究Pm在口腔扁平苔藓中的致病机理。

原代人口腔角质细胞在产黑普氏菌作用后的转录组分析

目的探究产黑普氏菌(Prevotella melaninogenica,P.m)作用下原代人口腔角质细胞(primary human oral keratinocytes,pHOK)的转录组变化,并在人口腔角质形成细胞(human oral keratinocyte,HOK)细胞系中进行验证。方法分离培养pHOK,并与P.m共培养4 h与24 h,提取总RNA,构建基因文库,转录组测序,分析差异表达基因,并进行基因本体论(gene ontology,GO)通路分析与京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析,在HOK与P.m共培养模型中采用qRT-PCR及Western Blot对差异基因进行验证。结果在pHOK与P.m共培养4 h组与对照组间上调表达的差异基因有:淋巴细胞胞浆蛋白1(lymphocyte cytosolic protein 1,LCP1)、角蛋白7(keratin 7,KRT7)、纤毛和鞭毛相关蛋白251(cilia and flagella associated protein 251,CFAP251)等,下调表达的差异基因有:含FERM、RhoGEF和Pleckstrin结构域蛋白1(FERM,ARH/RhoGEF and Pleckstrin domain protein 1,FARP1)、WW结构域转录调控因子1(WW domain containing transcription regulator 1,WWTR1)、含Discoidin、CUB和LCCL结构域蛋白2(Discoidin,CUB and LCCL domaincontaining protein 2,DCBLD2)等,共1788个差异表达基因;24 h组与对照组间上调表达的差异基因有:LCP1、补体C1s(complement C1s,C1S)、犬尿氨酸酶(kynureninase,KYNU)等,下调表达的差异基因有:磷酸丝氨酸转氨酶-1(phosphoserine aminotransferase 1,PSAT1)、FARP1、FKBP型脯氨酰异构酶10(FKBP prolyl isomerase 10,FKBP10)等,共1832个差异表达基因;其中共同差异表达基因(common differentially expressed genes,cDEGs)有LCP1、KYNU、长链非编码RNA958(long intergenic non-protein coding RNA 958,LINC00958)等1090个,差异均具有统计学意义。通过GO数据库分析,cDEGs主要富集到细菌对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、细胞的顶端部分等;通过KEGG分析,cDEGs富集到的通路有白介素-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、Toll样受体通路等;从cDEGs中筛选肌球蛋白1B(myosin1B,MYO1B)在HOK与P.m共培养模型中进行验证,qRT-PCR及Western Blot检测结果表明,MYO1B的表达在对照组和P.m刺激组之间存在显著性差异(P<0.001),且其表达随P.m刺激时间的延长及刺激浓度的增大而递增。结论P.m对口腔角质细胞的转录组存在重要影响。

唾液链球菌对小鼠口腔黏膜慢性炎症的治疗作用

目的:利用口腔黏膜慢性炎症模型,对唾液链球菌(Streptococcus salivarius,Ss)的抗炎作用进行初步研究。方法:(1)健康成年SPF级C57BL/6小鼠75只,随机分为5组,空白对照(CON)组、慢性炎症(CI)组、唾液链球菌治疗(CI+SS)组、糖皮质激素治疗(CI+GC)组和单独使用唾液链球菌(CON+SS)组各15只。4周后收集病损部颊黏膜,经苏木素-伊红(HE)染色后观察其病理变化及炎性细胞浸润情况,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)方法检测病损局部白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-17(IL-17)和叉头框蛋白3(Foxp3)的mRNA表达改变,采用免疫荧光染色法检测病损局部IL-6的蛋白表达情况。(2)健康成年SPF级C57BL/6小鼠45只,随机分为3组,CON组、CI组及CI+SS组各15只。4周后收集外周血,通过酶联免疫吸附法检测血清中IL-17A的表达水平,采用流式细胞术检测外周血Th17/Treg细胞比例。结果:(1)与CI组相比,CI+SS组病损局部炎性细胞浸润减少,IL-1β、IL-6和TNF-α的表达降低,IL-6阳性细胞减少(P<0.001);(2)CI+SS组病损组织中IL-10、IL-17和Foxp3的表达降低(P<0.01),血清IL-17A的表达降低(P<0.001),外周血Th17/Treg细胞比例下降(P<0.001)。结论:Ss局部使用具有改善口腔黏膜慢性炎症的作用,其机制可能是通过改善Th17/Treg分化失衡从而维持局部免疫平衡。