抗B7-H4单链抗体库的构建和筛选及抗体特异性鉴定

目的构建小鼠抗B7-H4胞外区核糖体展示单链抗体(sc Fv)库,并筛选出特异性高的抗体。方法从A549细胞的c DNA中扩增B7-H4胞外区基因,将其插入原核表达载体p ET-28 a(+)中表达,获得B7-H4胞外区重组蛋白后纯化并免疫BALB/c小鼠。从免疫小鼠脾脏中提取总RNA,并利用反转录PCR、重叠延伸PCR(SOE-PCR)等技术扩增出重链可变区(VH)、轻链可变区(Vκ)、VH接头(VH-linker)序列和Vκ接头(Vκ-linker)序列,得到重轻链可变区基因的连接产物VH/Vκ。VH/Vκ与p UM19-T载体连接并转化至E.coli DH5α感受态菌株中,利用菌落PCR技术鉴定并测序。使用TNTT7 Quick for PCR DNA试剂盒对构建出的抗体库进行体外翻译与筛选,采用Western blot法和间接ELISA对得到的抗体进行特异性鉴定。结果经生物公司测序分析,得到序列正确的重链可变区(VH)、轻链可变区(Vκ)及二者连接产物(VH/Vκ),大小分别为439 bp、680 bp及1098 bp。经特异性实验分析,从得到的抗体库中筛选出的抗体与B7-H4具有高特异性结合能力。结论成功构建出鼠抗B7-H4胞外区核糖体展示sc Fv库,并筛选出与B7-H4胞外区重组蛋白高特异性结合的目标sc Fv。

抗ICOSL核糖体展示单链抗体库的构建

[目的]构建出鼠源抗ICOSL核糖体展示抗体库。[方法]通过RT-PCR从人B淋巴瘤细胞Daudi的总RNA中扩增出ICOSL胞外区基因,并将此基因插入到原核表达载体pET28a中进行表达。以表达纯化的ICOSL蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠,取小鼠脾脏提取总RNA,通过RT-PCR扩增小鼠的重链可变区和Linker(VH-linker)序列,以及轻链可变区和Linker(Vκ-linker)序列。经重组PCR将两段基因连接起来,将VH/κ与pMD19-T载体链接产物转化E.coli DH 5α,PCR鉴定并测序。[结果]VH和κ链得到正确的扩增,长度分别为421和689 bp,VH/κ连接产物正确,连接产物长度为1 079 bp。[结论]所采用的引物及反应条件能够扩增出目的基因,成功构建了鼠源抗ICOSL核糖体展示抗体库,为进行核糖体展示体外筛选抗ICOSL特异性单链抗体奠定基础。

白藜芦醇对镉诱导HEK 293T细胞自噬与凋亡的影响

为了探究白藜芦醇与镉诱导人胚胎肾细胞293(HEK 293T)细胞自噬与凋亡之间的关系,本研究在已证明低浓度镉诱导细胞自噬,高浓度镉导致细胞凋亡的基础上,以HEK 293T细胞为研究对象,并分别与镉、白藜芦醇及各种抑制剂进行联合培养,利用免疫印记分析检测自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ、溶酶体标志蛋白cathepsin L、组蛋白去乙酰化酶相关蛋白SIRT1和凋亡蛋白caspase-3的表达水平,激光共聚焦检测细胞自噬质粒(GFP-LC3)和溶酶体相关膜蛋白结合因子(LAMP2)的表达量,同时检测活性氧(ROS)水平,倒置相差显微镜和流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果显示:白藜芦醇进一步增强镉诱导HEK 293T细胞的自噬,且这种效应发生在自噬体溶酶体融合之前,其作用原理可能与白藜芦醇的抗氧化性有关并与SIRT1基因有密切联系,以上结果说明白藜芦醇对镉诱导的细胞自噬有一定的调控作用,此外,细胞凋亡与自噬之间关系紧密,白藜芦醇可抑制镉诱导的细胞凋亡。