鸡传染性喉气管炎病毒PCR快速检测方法的建立

根据GenBank发表的传染性喉气管炎病毒(ILTV)TK基因序列(EF552578),设计合成了1对特异性引物,通过优化反应条件,成功地从ILTV疫苗株中扩增出329 bp特异性片段,而传染性支气管炎病毒、新城疫病毒及马立克病毒基因组均未扩增为出相应的片段。回收的PCR产物经EcoRⅠ酶切和测序鉴定,证实了该扩增片段的特异性。PCR检测ILTV DNA的最小检测量为30 pg。经临床初步应用表明,该方法的建立使传染性喉气管炎病毒的检测更为快速、简便、经济和实用。

一起皮肤型鸡痘的诊断与防治

2008年10月,河南省郑州市郊区某鸡场发生一起疑似鸡痘。将病鸡痘痂部位的皮肤和结节做成1∶10的悬液接种易感鸡,第6天后试验鸡表现精神萎靡,食欲减退,体重减轻,出现典型的皮肤痘疹;取病料接种鸡胚在鸡胚绒毛尿囊膜上出现豆粒大小的痘斑。结合发病情况、临床症状、剖检变化和实验室诊断,初步诊断为鸡痘。

鸡白细胞介素-18真核表达载体构建与ILTV弱毒疫苗联合免疫

为了探索鸡IL-18在传染性喉气管炎病毒(ILTV)弱毒疫苗中的免疫佐剂作用,将鸡IL-18(ChIL-18)克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/ChIL-18(简称pIL-18)。用pIL-18、ILTV弱毒疫苗及其两者联合分别免疫21日龄SPF雏鸡,免疫后每周抽取外周血及外周抗凝血,应用ELISA和流式细胞仪分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平。免疫后第4周用100 ELD50ILTV强毒进行攻击。结果pIL-18与ILTV弱毒疫苗联合免疫组的淋巴细胞亚群CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+明显高于ILTV弱毒疫苗免疫组(P<0.01),ILTV强毒攻毒后发病鸡数量少,并且发病症状较轻。

猪IL-18基因真核表达质粒的构建及其表达产物的生物学活性

【目的】构建猪IL-18的重组质粒,检测其表达产物的生物学活性,为进一步研究猪IL-18基因的结构与功能奠定基础。【方法】通过PCR技术从含猪IL-18全基因的克隆质粒中扩增猪IL-18基因,定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pIL-18,在脂质体作用下转染猪肾PK15细胞。【结果】重组质粒pIL-18经酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确。通过RT-PCR检测,证实了猪IL-18在PK15细胞中的表达;SDS-PAGE分析结果表明,表达产物是与猪IL-18相符的约22 ku的蛋白条带;Western blot证实,表达产物能与猪IL-18单克隆抗体发生特异性反应。pIL-18对H1亚型猪流感灭活疫苗免疫增强作用的研究表明,pIL-18能够提高猪流感灭活疫苗诱发的细胞免疫应答。【结论】成功地构建了猪IL-18的重组质粒pIL-18,并在PK15细胞中获得了瞬时表达,且具有一定的免疫原性。

一起鸡传染性支气管炎的诊断

2008年3月,河南汝洲某肉鸡场39日龄肉鸡发生一种以拉白色稀便并伴有呼吸症状及肾脏肿大为特征的疾病。根据鸡传染性支气管炎N基因序列设计并合成1对引物,提取病死鸡肾脏总RNA,经反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增,检测鸡传染性支气管炎病毒为阳性,结合病史和临床症状,诊断为鸡传染性支气管炎。

一起鸡传染性支气管炎的RT-PCR诊断

2008年11月,河南焦作某鸡场发生一起疑似鸡传染性支气管炎的疫情。根据鸡传染性支气管炎S1基因序列设计、合成1对引物,应用RT-PCR技术对病死鸡的气管和肾脏等组织进行RT-PCR扩增,扩增出预期目的基因。结合临床症状和病理剖检变化初步诊断为鸡传染性支气管炎。

一起育肥猪脑炎型链球菌病的诊断与防制

2008年2月,河南省荥阳市某猪场育肥猪发生一起疑似猪脑炎型链球菌病感染的病例。无菌采集病猪肝脏、脾脏、肾脏和脑组织,分离到链球菌,并进行了生化鉴定。实验室检查结果结合流行病学调查、临床症状和剖检变化,初步诊断为链球菌病,经药敏试验筛选药物治疗结合综合防制,迅速控制了病情。

鸡白细胞介素18基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

通过RT-PCR技术直接从罗曼鸡脾脏提取的总RNA中扩增鸡白细胞介素18(ChIL-18)全基因,并克隆和测序得到序列基因全长为597 bp的ChIL-18。将ChIL-18成熟蛋白编码区(510 bp)定向插入到原核表达载体pGEX-4T-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游,构建重组表达质粒pGEX-ChIL-18,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下可高效表达融合蛋白(GST-ChIL-18)。SDS-PAGE可检测到分子质量约为46 kDa的GST-ChIL-18。Western blot证实GST-ChIL-18能与鸡IL-18单克隆抗体发生特异性反应。融合蛋白GST-ChIL-18经谷胱苷肽Seph-arose-4B亲和柱层析纯化后明显促进鸡T淋巴细胞转化,表明所表达的ChIL-18具有一定的生物活性。

EDSV HN03株纤维蛋白基因的克隆与序列分析

【目的】研究减蛋综合征病毒(EDSV)河南HN03株纤维蛋白基因全序列,为进一步分析EDSV纤维蛋白基因的结构、功能以及EDSV基因工程疫苗的研究奠定基础。【方法】根据GenBank中收录的EDSV纤维蛋白基因序列(Z86065),设计并合成了1对引物,PCR扩增EDSV河南HN03株纤维蛋白基因。将扩增产物克隆入pTG19-T载体并测序。【结果】测序结果表明,HN03株纤维蛋白基因为1935 bp,包含一个完整的开放阅读框,编码644个氨基酸,推导的氨基酸序列有5个潜在的N-糖基化位点,有5个与二硫键形成有关的半胱氨酸。序列分析表明,EDSV HN03株与EDSV国际标准株AV-127纤维蛋白基因核苷酸同源性为99.3%,氨基酸同源性为99.2%;与鹌鹑腺病毒QU株纤维蛋白基因核苷酸同源性为98.9%,氨基酸同源性为98.4%。【结论】腺病毒纤维蛋白基因相当保守。

ILTV Glycoprotein B(gB)与鸡Interleukin-18(IL-18)真核双表达载体的构建及表达

将ILTVgB基因和鸡IL-18基因插入到真核双表达载体pIRES中,构建共表达gB和IL-18基因的重组质粒pIRES-gB/IL18和表达gB基因的pIRES-gB质粒。通过脂质体将其转染鸡胚成纤维细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光检测重组质粒在体外的表达。将重组质粒通过腿部肌肉多点注射免疫21日龄雏鸡,应用ELISA和流式细胞仪分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平。结果显示,pIRES-gB/IL18和pIRES-gB转染细胞中分别含gB/IL-18基因的mRNA和gB基因的mRNA。间接免疫荧光检测表明,pIRES-gB/IL18和pIRES-gB在CEF细胞中有效地转录并表达gB蛋白。pIRES-gB/IL18和pIRES-gB免疫雏鸡后均能促进外周血T淋巴细胞亚群数量和血清中特异性抗体水平的增加,但前者的免疫效果明显优于后者,表明gB基因和鸡IL-18基因均获得了表达,且鸡IL-18能明显增强ILTV DNA疫苗诱发的免疫应答。

鸡传染性支气管炎病毒HZ13株的分离与鉴定

从浙江省某肉鸡养殖场发生疑似肾型传染性支气管炎的发病鸡群中采集病料,进行病毒分离。结果显示,经1%胰酶处理后,该病毒尿囊液可以凝集鸡的红细胞,而未处理的病毒尿囊液则无此凝集活性;该分离株对新城疫病毒(La Sota)株增殖具有明显的抑制作用;对10日龄鸡胚的致病变率达100%;通过鸡胚矮小化试验和动物回归试验,发现该分离株能引起鸡胚和病鸡典型的临床症状和病理变化;RT-PCR可扩增出768 bp片段,测序比对结果证实分离获得了1株肾型鸡传染性支气管炎病毒,命名为HZ13株。

不同抗原含量鸡减蛋综合征灭活疫苗的HI效价测定

为优化鸡减蛋综合征相关多联灭活疫苗的生产工艺,利用Pellicon切向流超滤系统,将制备的鸡减蛋综合征病毒液6.5倍浓缩,0.1%(V/V)甲醛灭活。将抗原液用灭菌生理盐水进行1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256稀释,按照常规生产工艺规程分别制备灭活疫苗,免疫21日龄SPF雏鸡。21d后翅静脉采血,HI试验检测免疫鸡的抗体水平。结果显示,免疫鸡HI抗体效价几何平均值均不低于7.0log2,符合鸡减蛋综合征灭活疫苗质量标准要求。

不同抗原含量鸡新城疫灭活疫苗的HI效价测定

新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一种禽类急性、高度接触性传染病，导致鸡群生产性能下降和大批死亡，造成巨大的经济损失。

猪乙型脑炎病毒灭活疫苗(A6株)的制备及免疫保护研究

为了制备猪乙型脑炎病毒(A6株)灭活疫苗,并研究其免疫保护效果,试验将猪乙型脑炎病毒(A6株)在Vero细胞上培养增殖,用β-丙内酯灭活,将检验合格的抗原与206疫苗佐剂乳化制备成猪乙型脑炎病毒灭活疫苗(A6株)。将制备的猪乙型脑炎病毒灭活疫苗(A6株)用PBS稀释成1∶5、1∶50、1∶5003个稀释度免疫小鼠后攻毒,后备母猪肌肉注射猪乙型脑炎病毒灭活疫苗(A6株)后间隔14 d后加强免疫1次,对免疫后备母猪及所产仔猪的中和抗体效价进行测定。同时,进行后备母猪免疫攻毒试验,分为疫苗免疫组和攻毒对照组,母猪妊娠30 d后用猪乙型脑炎病毒(A6株)进行攻毒,攻毒后记录各组母猪临床症状及所产仔猪的健康状况,发病仔猪剖检,观察病变。结果表明:猪乙型脑炎病毒灭活疫苗(A6株)1∶50倍稀释免疫小鼠进行攻毒,保护率可达到80%。后备母猪间隔14 d免疫两次可以产生高水平的中和抗体,而且所产仔猪的中和抗体效价可以维持到30日龄。对妊娠30 d母猪进行攻毒,疫苗免疫组妊娠母猪均正常产仔,仔猪全部健活,全部保护;攻毒对照组妊娠母猪发生流产,产出死胎、木乃伊胎和弱胎,全部发病。发病胎儿剖检,可见脑积水、皮下水肿、胸腔和腹腔积液、淋巴结充血等病理变化。说明猪乙型脑炎病毒灭活疫苗(A6株)具有良好的免疫保护效果。

猪蓝耳病流行特点及疫苗研究进展

本文将猪蓝耳疫苗的研究进展归纳和总结,提出免疫防控策略,以减少PRRS带来的经济损失。

不同抗原含量鸡减蛋综合征灭活疫苗的HI效价测定

为优化鸡减蛋综合征相关多联灭活疫苗的生产工艺，利用Pellicon切向流超滤系统，将制备的鸡减蛋综合征病毒液6．5倍浓缩，0．1％（V／V）甲醛灭活。将抗原液用灭菌生理盐水进行1：8、1：16、1：32、l：64、1：128、1：256稀释，按照常规生产工艺规程分别制备灭活疫苗，免疫21日龄SPF雏鸡。21d后翅静脉采血，HI试验检测免疫鸡的抗体水平。结果显示，免疫鸡HI抗体效价几何平均值均不低于7．0log2，符合鸡减蛋综合征灭活疫苗质量标准要求。

2019年四川省部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为了解2019年四川省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因的遗传变异情况,采用RT-PCR方法对来自该省部分地区猪场的36份疑似PRRS猪的组织样品进行PRRSV ORF5基因测序,并对所获得的基因序列进行了生物信息学分析。结果显示,成功扩增出14条PRRSV ORF5基因片段。同源性分析显示,14条PRRSV ORF5基因序列均为基因Ⅱ型毒株,分属于1、3、8这3个不同的谱系,以NADC30为代表的谱系1和以QYYZ为代表的谱系3各5株,以JXA1为代表的谱系8毒株4株,各毒株间核苷酸和推导氨基酸的同源性分别为78.5%~100.0%、78.0%~100.0%。氨基酸序列分析结果显示,14个毒株GP5蛋白上3个主要的抗原表位上均存在广泛的变异,同时谱系1和谱系3毒株与毒力相关的位点也发生了不同程度的突变,这些突变可能影响病毒毒力及有助于病毒逃避机体的免疫系统。结果表明,2019年四川省PRRSV呈多亚型毒株同时流行的复杂局面,有必要对PRRSV的流行和变异情况进行实时监测,以此选择更为合适的疫苗毒株及免疫程序,结合严格的生物安全措施,从而达到科学防控PRRS的效果。

猪乙型脑炎病的诊断与防控

猪乙型脑炎是一种人畜共患病,是由乙型脑炎病毒引起的一种急性、发热性传染病,猪是本病最重要的传染源和储存宿主。2021年7月,某养猪场发生了以母猪流产和公猪睾丸炎为主要发病特征的传染病,通过在养猪场开展流行病学调查,观察临床发病症状和剖检病理变化,结合实验室病原PCR检测、病毒分离培养、病毒含量测定、病毒中和等试验方法,确诊该养殖场感染猪乙型脑炎病毒造成发病。该养猪场通过采取加强饲养管理和疫苗紧急免疫接种等综合防控措施,取得了很好的防控效果。

猪圆环病毒2型灭活疫苗生产关键技术

猪圆环病毒2型（PCV-2）在我国乃至全世界猪群中广泛传播,是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原,PCV-2能造成仔猪生长缓慢,饲料报酬降低,同时侵害猪的免疫系统,导致机体免疫力下降,引起其他疫病的暴发,是近年来危害养猪业的主要免疫抑制病之一[1].我国自2000年首次报道猪群中存在PCV-2感染[2],之后在全国各地陆续有报道,呈逐渐蔓延趋势.近年来,PCV-2的发生和流行,给我国养猪业造成了巨大的经济损失.

不同免疫佐剂对猪PCV2灭活疫苗效果的影响

分别用ISA11R、ISA35和ISA28三种水包油型佐剂制备PCV2灭活疫苗样品,并依次小鼠腹腔注射进行免疫效果比较。临床观察、血清抗体检测及免疫攻毒保护试验结果表明:相比矿物油佐剂ISA11R以及矿物油与非矿物油混合佐剂ISA28而言,非矿物油佐剂ISA35制备的疫苗免疫安全性好,免疫保护率高,可作为PCV2灭活疫苗理想的候选佐剂。