葡萄糖基转移酶在α-葡萄糖基化丁香酚生物合成中的应用

丁香酚因具有抑菌、抗肿瘤、廉价易得等特性,被广泛应用于医药、香料及调味剂等领域。但因其不稳定、易升华、水溶性差等缺点,限制了它的进一步应用。糖基化修饰可显著提高丁香酚的应用特性,本研究利用重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)p ET28a-agl A高效表达的源自野油菜黄单胞菌的葡萄糖基转移酶,生物催化丁香酚生成α-葡萄糖基化丁香酚(α-EG)。同时对其生物合成中酶催化反应性质进行了研究。结果表明其最适反应条件:pH=8.5,温度为35℃,丁香酚与麦芽糖最适浓度分别为60 mmol/L及1.2 mol/L。该酶在pH 6~8及4℃~30℃内能保持较好的稳定性。1 mmol/L金属离子Cu^(2+)能强烈抑制糖基转移酶活性,而1 mmol/L金属离子Fe^(2+)对酶的催化反应有显著的促进作用。采用最优催化条件,反应100 min,α-葡萄糖基化丁香酚(α-EG)的转化率为75%。

一种转葡萄糖苷酶基因的克隆表达及其生物催化合成α-熊果苷

通过一步法克隆试剂盒将来自野油菜黄单胞菌的转葡萄糖苷酶基因与表达载体pET28a同源重组,构建质粒pET28a-agl,并转化到不同感受态细胞中,筛选出高效表达转葡萄糖苷酶的基因工程菌E.coli BL21 Gold(DE3)plysS pET28a-agl,以催化合成α-熊果苷。利用IMAC亲和层析,获得转葡萄糖苷酶用于其酶学性质的研究。催化合成α-熊果苷的较佳反应条件为:转葡萄糖苷酶的质量浓度0.272 5 g/L,对苯二酚质量浓度11 g/L,麦芽糖浓度1.1 mol/L,磷酸盐缓冲液浓度100 mmol/L(pH=6.5),30℃下摇床反应3 h。研究发现,反应产物α-熊果苷对转葡萄糖苷酶反应有轻微的抑制作用;1 mmol/L K^+对转葡萄糖苷酶的相对酶活有提高作用,1 mmol/L Cu^(2+)几乎能完全抑制该酶活性。