抗血小板单克隆抗体片段的抗栓效应研究

目的 :研究抗血小板膜糖蛋白IIIa(GPIIIa)单克隆抗体 (mAb)SZ 2 1F(ab′) 2 片段的抗血栓效应。方法 :用木瓜蛋白酶在偏酸条件下 ( pH5 .5 )消化 2 0h ,经DEAE 5 2NaCl梯度洗脱消化产物 ,以得到F(ab′) 2 片段。收集产物经SDS PAGE鉴定 ,并通过ELISA和血小板聚集抑制试验 ,观察所获F(ab′) 2 片段免疫原活性和抗栓活性。结果 :该法制备F(ab′) 2 片段的得率为 6 0 .32 % ;酶免法测定其效价为 0 .8× 10 -9mol/L ;体外血小板聚集抑制半数有效剂量 (ED5 0 )为 3.395mg/L。F(ab′) 2 片段与血小板的结合性及对血小板聚集功能的抑制效果均高于完整的IgG。 结论 :利用木瓜蛋白酶制备的抗血小板mAbSZ 2 1的F(ab′) 2 片段 ,产率高且其抗栓活性与免疫原活性均优于完整的mAbIgG ,为mAbSZ 2

血小板微颗粒和血小板活化的关系

血小板粘附于受损血管壁或受诱导剂作用而活化时,通过向细胞外出芽方式形成囊泡而释放或伪足断裂而形成血小板微颗粒(platelet microparticles,PMP).PMP体积小于正常血小板但具有完整的膜结构.PMP膜上表达一些血小板的膜糖蛋白(GP)(主要是GPⅡ b/Ⅲa和GP Ⅰ b/Ⅸ)、血小板活化因子(PAF)、β-淀粉样前体蛋白、Ga2+依赖性蛋白酶Calpain和有促凝作用的磷脂等.因此PMP可进一步活化血小板以及为凝血瀑布提供更大的磷脂催化表面,在血管损伤的正常止血过程中起一定作用.在循环血中PMP的曾高与越来越多的临床疾病相关联,所以对PMP的研究日渐增加.

人vWF-A1区蛋白的表达及其对血小板聚集的抑制作用

目的 :进一步研究血栓形成的机制 ,开发抗血栓药物。方法 :应用基因重组技术在大肠杆菌中表达人vWF -A1区蛋白 ,经过纯化、复性 ,获得重组蛋白 (rvWF -A1) ,同时用流式细胞术检测rvWF -A1与血小板膜糖蛋白血小板膜糖蛋白 (glycoprotein ,GP)Ib的结合能力 ,应用血小板聚集仪测定rvWF -A1对瑞斯托霉素 (ristocetin)诱导的血小板聚集抑制作用。结果 :重组表达载体pQE -3 1-vWF -A1在大肠杆菌M15中得到高效表达 ,表达的重组蛋白量占菌体总蛋白的 3 0 % ,Ni -NTAagrose柱纯化后 ,其纯度为 95% ,经复性的rvWF -A1蛋白具有良好的生物学活性。它可与血小板模糖蛋白血小板膜糖蛋白GPIb结合 ,阳性率为 78 6% ;它可以抑制ristocetin诱导的血小板聚集 ,抑制率为 84 7%。结论 :在原核细胞中可以成功地高效表达人vWF -A1区蛋白 。

血管抑素对人胰腺癌细胞生长的体内抑制作用

目的 探讨血管抑素 (An)对实验性人胰腺癌的治疗作用及生物学特征。方法 用人胰腺癌细胞系Patu 8988接种裸鼠制备动物模型 ,用An(2 5、5 0、10 0mg/kg)对瘤部进行注射治疗 30天 ,观察动物行为 ,测量不同治疗剂量组与对照组瘤体大小 ;对肺、肝、肾及肿瘤进行病理学检查 ,并对其肿瘤区的血管密度进行检测。结果 在肿瘤种植 30天时 ,对照组与 2 5、5 0、10 0mg/kgAn组肿瘤重量分别为 1 77± 0 4 2、0 74± 0 4 0、0 4 9± 0 2 1和 0 2 5± 0 13g ,An抑瘤率分别为 5 7%、72 %和 86 % ,10 0mg/kgAn抑瘤作用最明显 ,此外瘤体体积、微血管形成也有相应变化。结论 An对胰腺癌生长有明显的抑制作用 ,可作为临床上一种新的抗肿瘤药物。

重组血小板糖蛋白Ibα活性片段在CHO细胞中表达及其功能研究

目的:建立表达重组糖蛋白Ibα活性片段(rGPIbαH1-V289)细胞株,并且纯化其表达产物,研究其生物学功能。方法:利用脂质体将含有编码GPIbαH1-V289的DNA质粒pCMV3转染CHO细胞。用亲和层析法纯化重组片段。用SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化产品的纯度和免疫学活性。用血小板聚集法检测纯化产品对瑞斯托霉素诱导血小板聚集功能的影响。用ELISA测定纯化产品对vWF与血小板结合能力的影响。结果:每1L培养上清液可纯化到6.15mgrGPIbαH1-V289重组产品。SDS-PAGE显示,纯化的重组片段主要在42kD处显一蛋白区带,Western blot显示,抗GPIbα单抗SZ-2能与重组片段在42kD处显单一蛋白区带。纯化重组片段能抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集功能。ELISA测定显示纯化产品抑制血浆vWF与血小板的结合能力。结论:CHO细胞株A1能恒定表达rGPIbαH1-V289,重组片段具有较高的纯度、免疫学活性和生物学活性,有可能开发为有效的抗血栓药物。

急性心肌梗死患者血浆中血小板P-选择素和血小板膜蛋白V的动态变化及其临床意义

目的观察急性心肌梗死(AMI)患者血浆中血小板P-选择素(P-selectin)和血小板膜蛋白V(GPV)的动态变化,探讨急性心肌缺血前、后血小板活化的临床意义。方法采用酶联免疫方法测定31例住院AMI患者发病12 h内,第2 d,第3 d和1周时及30例正常人血浆中的P-selectin和GPV的含量,并对其动态变化进行比较。结果AMI患者12 h起P-selectin和GPV浓度明显高于正常组(P<0.01),其中GPV当天达到高峰,P-selectin则在第2 d达到高峰,第7 d基本恢复正常范围(P>0.05)。结论GPV可以作为反映冠心病患者病程中血小板活化程度的一项新指标。

抗血小板糖蛋白VI单克隆抗体的制备及其功能研究

目的:制备抗血小板糖蛋白VI(GPVI)单克隆抗体,观察其在体外抗血小板黏附和聚集功能。方法:采用基因重组技术体外表达血小板糖蛋白VI胞外区重组蛋白(rGPVI)。以rGPVI免疫小鼠,经细胞融合及筛选后制备抗GPVI单克隆抗体。采用血小板聚集实验观察该单抗对胶原、Convu lxin及ADP诱导的血小板聚集的影响;利用平行板流动小室技术研究在高剪切力条件下该单抗对血小板在胶原表面黏附的抑制效果。结果:正确构建了rGPVI表达载体pET-20b(+)-GPVI,rGPVI在原核细胞中有效表达。rGPVI能够被抗Penta-H is单抗和抗GPVI多抗识别。制备的抗GPVI单克隆抗体SZ118能够识别rGPVI,并与血小板有特异的结合能力。SZ118能明显抑制纤维状胶原和Convu lxin诱导的血小板聚集,呈抗体剂量依赖性;对ADP诱导的血小板聚集无明显影响。血小板黏附实验表明,SZ118能够明显阻断在高剪切力条件下血小板与纤维状胶原表面的黏附。结论:成功制备抗GPVI单克隆抗体SZ118,该抗体与血小板有良好的结合能力,显著抑制胶原诱导的血小板聚集并明显降低血小板与胶原的黏附反应。

抗血管性血友病因子单克隆抗体的制备及其初步鉴定

目的 研制抗人血管性血友病因子 (vWF)单克隆抗体 (McAb) ,鉴定其各种生物学特性。方法 Ⅷ因子浓缩物经Sepharose 4B凝胶柱提纯出vWF蛋白 ,免疫Balb/c小鼠 ,按常规方法融合并经间接ELISA方法筛选 ,制备稳定分泌抗vWFMcAb的细胞株 ,并对McAb的亚型、免疫活性及组织特异性等进行鉴定 ,运用放射免疫方法等与单抗SZ - 2 9,SZ - 34进行比较。结果 分离纯化出vWF ,vWF抗原含量为 12 0IU/mg ,并成功制备了一株抗人血管性血友病因子McAb ,暂命名为 4E10。琼脂糖双扩散鉴定为IgG1类 ,ELISA法测定其腹水效价为 5× 10 -5。放射免疫分析证实McAb4E10能特异的与血浆中vWF蛋白结合 ,应用间接免疫荧光法显示出与人脐静脉内皮细胞内vWF所特有的颗粒型荧光反应。流式细胞仪及免疫组化法测定表明McAb4E10与人脐静脉内皮细胞反应呈阳性 ,与外周血红细胞、白细胞、未活化的血小板不反应 ,而与其他组织细胞没有反应。放射免疫测定证实McAb4E10与SZ - 2 9,SZ - 34识别vWF蛋白上不同的结构。还原条件下Westernblot法证实McAb4E10和SZ -2 9都能识别相对分子量为 2 2 5kD和 180kD左右的单链蛋白多肽。结论 制备出了抗人血管性血友病因子单克隆抗体 4E10 (McAb4E10 ) ,它能特异识别血浆及内皮细胞的vWF 。

恶性淋巴瘤单克隆抗体的制备和初步鉴定

采用人恶性淋巴瘤细胞株Raji细胞作为免疫原免疫BALB/C小鼠 ,按常规方法融合并经间接ELISA法筛选 ,成功地制备了 1株抗Raji细胞单克隆抗体 (MAb) ,命名为SZ1 38。用琼脂糖双扩散鉴定其为IgG1 类 ,ELISA法测定其腹水效价为 1 :3.2× 1 0 4。MAb流式细胞仪检测表明 ,该抗体与Raji和Daudi呈阳性反应 ;与外周红细胞、白细胞 (包括淋巴细胞和中性粒细胞 )、未活化血小板、内皮细胞株ECV呈阴性反应。免疫组化SP法显示 ,MAbSZ1 38识别的抗原在胃肠道的腺体和肝脏有所表达 ,而在心、脑、扁桃体、脾、脂肪组织、动脉血管壁、神经节、横纹肌、平滑肌等组织不表达或表达很低。Westernblotting分析显示 ,MAbSZ1 38可特异识别还原条件下相对分子量为 1 70kD的蛋白多肽。结果提示 :MASZ1 38对恶性淋巴瘤的诊断和治疗可能具有一定的临床意义。

抗人血小板膜糖蛋白Ⅲa单克隆抗体抑制兔血栓形成的实验研究

目的 评价抗人血小板膜糖蛋白Ⅲa单克隆抗体SZ2 1抑制兔血栓形成的能力。方法不同浓度的SZ2 1( 0、10及 2 0 μg/ml)分别加入兔富血小板血浆 (PRP)中 ,进行二磷酸腺苷 (ADP)诱导的兔血小板聚集试验 ;体内注射SZ2 1( 1 5mg/kg) ,注射前及注射后 5、30及 6 0分钟时制备兔PRP ,分别进行聚集试验 ;用颈动静脉旁路血栓模型研究SZ2 1对兔血栓形成的作用 ,2 0只新西兰兔随机分成 4组 ,体内注射SZ2 1,剂量为A组 0 1mg/kg ,B组 0 4mg/kg ,C组 0 75mg/kg ,D为对照组 (SZ391mg/kg) ,然后测定血栓重量。 结果 体外 2 0 μg/ml的SZ2 1对兔血小板抑制率为 80 % ;SZ2 1体内注射 6 0分钟时完全抑制血小板聚集功能 ;血栓模型分组试验 ,各组平均栓重为A组 31mg ,B组 2 1mg ,C组 2 0 2mg ,D组 31mg ,B、C组与对照组间有明显统计学差异 (P <0 0 1)。 结论 单克隆抗体SZ2

抗血小板膜糖蛋白Ib凝血酶受体单抗的制备及功能研究

目的 制备抗人血小板膜糖蛋白Ｉｂ(ＧＰＩｂ)单克隆抗体(单抗)并研究其功能。方法杂交瘤技术制备单抗,ＥＬＩＳＡ法筛选与 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定单抗识别的抗原,比浊法检测该单抗对血小板聚集的抑制作用。结果(ｌ)获得一株新的抗人血小板膜糖蛋白单抗ＳＺ１６。(２)在非还原状态下,ＳＺ１６识别分子量１６５０００的抗原,表明ＳＺ１６抗原为ＧＰＩｂ。(３)该单抗为ＩｇＧ１亚类。(４)ＦＣＭ检测表明,ＳＺ１６与正常人及血小板无力症(ＧＴ)患者血小板结合率很高;用凝血酶处理血小板后,几乎完全阻断ＳＺ１６与血小板的结合。(５)该单抗抑制低浓度凝血酶引起的血小板聚集,对ＡＤＰ、瑞斯托霉素和花生四烯酸引起的血小板聚集无抑制作用。结论ＳＺ１６为一株新的抗ＧＰＩｂ凝血酶受体的单抗。

GPIb是血小板膜上一种重要的凝血酶受体

目的 研究GPIb在凝血酶诱导的血小板活化过程中的作用。方法 FCM法检测SZ - 16的组织特异性 ,比浊法检测该单抗对血小板聚集的抑制作用 ,放射免疫法检测SZ - 16对凝血酶诱导的血小板活化的影响。结果 SZ - 16只与血小板结合 ,不与红细胞、白细胞和内皮细胞结合 ;血小板聚集实验表明 ,SZ - 16对凝血酶诱导的血小板聚集有抑制作用 ;放射免疫结果表明 ,SZ - 16抑制凝血酶引起的GMP140释放和TXB2的产生。结论 GPIb是血小板上的一种重要的凝血酶受体。

抗血小板膜糖蛋白SZ-21单链抗体的制备和生物学特性研究

目的 将能与血小板膜糖蛋白Ⅲa特异结合的单克隆抗体SZ 2 1构建成单链抗体 (SZ 2 1ScFv) ,为其临床应用奠定基础。方法 构建SZ 2 1ScFv基因的质粒pET2 0b 2 1ScFv ,在大肠杆菌EcoliBL2 1(DE3)PlysS中表达了功能分子。表达产物经过包涵体的溶解、Ni NTA树脂亲和吸附纯化和蛋白质的体外复性过程 ,获得具有生物活性的高纯度单链抗体片段。结果 体外实验证实表达量占菌体蛋白的 2 1%。SZ 2 1单链抗体能够抑制ADP诱导的血小板聚集 ,其抑制能力呈剂量依赖性 ,在浓度为2 0 μg/ml时达到最大抑制率。流式细胞术检测证实该单链抗体能与内皮细胞反应 ,同时也可以抑制纤维蛋白原与血小板的结合。结论 表达的单链抗体具有抑制血小板聚集和抑制纤维蛋白原与血小板结合的能力 。