水貂阿留申病的防制

简述了阿留申病对养貂业的严重危害及其症状和病原性。概述了当前此病的 3种防制措施 :应用对流免疫电泳 (CIEP)特异诊断阿留申病 (AD) ,淘汰阳性貂 ,净化种群 ;筛选抗阿留申病个体 ,进行抗病育种 ;研制疫苗 ,开展免疫预防综合性防制。

生物软件在序列分析过程中的运用

介绍了组合使用BLAST、FASTA/BLASTScan3.2,或用多序列比对软件,从数据库中快速提取大数量目标序列,最后用MEGA4快捷编辑整理大数量序列的方法。还介绍了一种生成核酸序列与其氨基酸序列相似性百分率整合表格的方法。简述了对引物设计的基本认识并介绍了多重引物兼容性筛选软件;对构建系统发育树的认识并引出分子进化树构建软件MEGA4的使用和PAUP 4.0常用建树命令模块。期望这些方法和软件的使用能解决生物序列分析过程的常见问题。

大数量序列的PCR保守引物设计实践

引物设计前的序列的全面检索,未注释序列的归类,经多序列比对求带有模糊碱基代码标识(IUPAC ambiguity codes)的共有序列,对设计高质量的引物至关重要,是引物设计过程的难点。目前,综合性核酸序列分析软件,单功能应用软件,在解决上述问题时均显不足。应用互联网提供的在线生物应用程序实践了一种多程序组合使用设计大数量序列的保守引物的方法,探讨了实现大数量序列的保守引物设计的一般流程。

节瘤拟杆菌PCR检测方法的建立

根据节瘤拟杆菌特有保守序列设计引物,利用聚合酶链式反应(PCR)建立了一种鉴别检测该菌的方法。对可能影响PCR检测结果的一系列因素进行了较详细的研究,选择了适宜PCR检测的快捷处理病样获得反应模板的方法,对PCR反应条件进行了优化,使对已知菌株培养物检测灵敏性最高可到30个菌/30μL反应体系;用广泛的相关菌株和菌群验证引物的特异性,证明设计的引物特异性强。将PCR方法用于临床病样的初步检测,部分病样PCR检测阳性。为用PCR方法检测节瘤拟杆菌引发的牛、羊、鹿腐蹄病奠定了基础。

狂犬病毒RT-PCR检测方法的建立

根据狂犬病毒保守序列设计引物,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)建立了一种检测狂犬病毒的方法,以期实现对严重危及人和动物生命安全的狂犬病毒直接检测。

水貂阿留申病PCR完全诊断技术

本研究参考并分析GENBANK中阿留申病毒、肠炎细小病毒的序列及本实验室测序的两种病毒序列，设计并实验筛选出阿留申病毒诊断引物2对和肠炎细小病毒1对；其中阿留申病毒诊断引物ADV537与肠炎细小病毒引物PAR593组成联合诊断引物。由于2种病毒同属细小病毒属，基因某些区段相似，用于2种病毒的鉴别诊断、阿留申病毒与肠炎细小病毒混合感染的诊断。

节瘤拟杆菌PCR检测方法的初步应用

本研究在建立节瘤拟杆菌PCR检测方法的基础上,将PCR方法用于临床样品的检测。PCR检测发现制约PCR直接检测临床样品检出率的主要因素是临床样品中细菌外的抑制物;采自趾叉皮炎的临床样品16份PCR检测呈阳性,趾叉皮炎是腐蹄病的初期感染症状;而其它蹄病后期症状临床样品PCR检测均为阴性,表明PC R检测方法适宜腐蹄病的早期诊断。

水貂秋冬季流行腹泻病病原调查

我们对主养殖区水貂秋、冬季流行性腹泻样品开展系统病原检测，主要检测出冠状病毒、杯状病毒、星状病毒等腹泻相关病毒；肠道杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌群丰度升高。病原不同地区分布不同。腹泻显现病毒、细菌混合致病。

A型流感病毒及其亚型H5、H7、H9分型RT-PCR检测方法初探

本研究验证了来自资料的A型流感M基因通用引物AIM、通用反转录引物AIU的可用性;参考并分析GENBANK中A型流感的H5、H7、H9亚型病毒序列自行设计H5、H7、H9亚型的分型引物,尝试用RT-PCR方法对A型流感病毒及其H5、H7、H9亚型病毒分型检测,进一步确定3种病毒亚型的诊断流程。

水貂犬瘟热CDV_3疫苗株基因组序列测定及H基因遗传稳定性分析

对水貂犬瘟热CDV3疫苗株基因组进行全序列测定与分析，以阐明该疫苗株的来源亲本毒株，基因特征及H基因遗传稳定性。将CDV3疫苗株基因组cDNA分9个重叠片段进行RT-PCR并克隆入pMD 18-T载体中，测定全长cDNA序列。并与CDV野毒参考株和疫苗株N、F和H基因氨基酸序列比对分析其基因变异情况。通过对CDV3疫苗株6个不同生产批次（Veto细胞培养代次）H基因序列测定以分析毒株的分子遗传稳定性。基因序列分析结果表明：CDV3疫苗株基因组全长15690bp，与CDV野毒株基因组同源性较低（93．0％～95．3％）。H基因核苷酸和氨基酸序列与Lederle疫苗株（EF418783）同源性最高，分别为99．6％和98．7％。而6个不同培养代次CDV3疫苗株H基因氨基酸序列无任何差异。由此证实CDV3疫苗株的亲本毒株与Lederle疫苗株有着最密切关系，不同培养代次的CDV3疫苗株H基因具有较高的遗传稳定性。

水貂、狐狸和貉源犬瘟热病毒F蛋白信号肽区基因克隆及遗传变异分析

为了解近年来犬瘟热病毒（canine distemper virus，CDV）在中国毛皮动物主要养殖区的流行情况及遗传变异情况，本试验于2012—2014年从山东、河北、辽宁收集疑似犬瘟热的水貂、狐狸和貉病料，经犬瘟热抗原检测试纸条检测和RT-PCR检测为阳性后，克隆测序了15株CDVF蛋白信号区（Fsp）基因序列。序列分析结果显示，15株CDV野毒株Fsp基因核苷酸序列和氨基酸序列的相似性均为93．6％～100．0％，与疫苗株相似性为80．7％～81.7％。基因系统进化分析结果显示，15株野毒株均属于中国当前流行的Asia-1基因型。氨基酸序列比对分析结果显示，Fsp蛋白在氨基酸3—14、16—37、47—67位等处存在高变异。通过对当前流行CDV野毒株Fsp基因序列分析，结果表明该Fsp基因区具有较高的变异率，可作为CDV基因分型的依据，同时本试验结果为毛皮动物犬瘟热的防控提供了参考依据。

犬瘟热病毒RT-nested PCR检测方法的建立与应用

根据犬瘟热病毒(CDV)弱毒株Onderstepoort的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计了套式引物,建立了RT-nested PCR检测方法。特异性试验表明,该法可以特异扩增出CDV NP基因片段,但从RNA病毒狂犬病病毒(RV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬冠状病毒(CCV),DNA病毒犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV)及正常Vero细胞中均不能扩增出条带。敏感性试验表明,RT-PCR可以扩增10-6稀释度的病毒RNA,而建立的RT-nested PCR可以扩增到10-9稀释度的病毒RNA,后者的敏感性明显高于前者。用RT-nested PCR法检测了2006年我国东北地区临床表现犬瘟热症状的病例19例,检出率达90%,明显高于RT-PCR的检出率(45%)。部分病例扩增片段的测序结果表明,CDV NP基因出现个别碱基变异。研究结果表明,建立的犬瘟热病毒RT-nested PCR方法敏感、特异,适用于动物犬瘟热的快速诊断。

水貂肠炎细小病毒分离鉴定

从送检的疑似水貂病毒性肠炎的水貂粪便中分离出一株病毒,经形态学、理化特性、血清学和动物试验鉴定表明,分离的病毒为水貂肠炎细小病毒。

核酸水平检测犬副流感病毒方法的建立

根据GenBank中与犬副流感(CPIV)同源性较近的SV5病毒N基因保守序列,利用DNAStar软件设计了一对特异性引物,能扩增265bp大小的片段,并以此建立了检测CPIV的RT-PCR方法,实验证明该对引物特异扩增CPIV;不扩增犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒和狂犬病病毒犬的四种病原的核酸。检测临床病料20份,其中2分为CPIV阳性。此法敏感性较高。是检测犬急性传染性呼吸道疾病(CIRD)中CPIV的有效的方法。

水貂肠炎细小病毒灭活疫苗抗体消长规律的研究

应用血凝抑制试验对水貂肠炎细小病毒灭活疫苗免疫水貂进行抗体水平动态监测，结果表明，疫苗接种14d抗体达到保护，21～30d抗体水平达到高峰；免疫180d抗体仍在保护值以上。攻毒试验证实，免疫180d后90％免疫水貂获得保护，确定水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗免疫保护期可持续6个月。

水貂肠炎病毒VP2基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

利用昆虫杆状病毒表达系统表达水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV)VP2基因,表达的蛋白能够形成病毒样粒子,具有反应原性,为研究MEV新型疫苗奠定基础。采用PCR方法扩增MEVVP2基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体,目的基因定向克隆到pFast-BacⅠ载体中,构建重组转座载体后转化DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染Sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行Western blotting鉴定。结果成功克隆MEVVP2基因。Western blotting结果证实,表达蛋白能够被MEV单克隆抗体识别。在Bac-To-Bac杆状病毒表达系统中成功的表达了MEV VP2蛋白,目的蛋白具有较好的反应原性。

狐传染性脑炎活疫苗抗体消长规律的研究

应用血清中和试验和血凝抑制试验对狐传染性脑炎活疫苗免疫狐进行抗体水平动态监测,结果表明,疫苗接种14 d抗体达到保护,21～30 d抗体水平达到高峰;免疫240 d抗体仍在保护值以上.对SN抗体和HI抗体进行动态分析表明,两者呈正相关,均可用于狐传染性脑炎活疫苗免疫效力监测.

水貂肠炎细小病毒PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank上已发表的水貂肠炎细小病毒基因序列,在其编码VP2结构蛋白基因的高度保守区内,设计合成1对特异性引物,建立水貂肠炎细小病毒PCR诊断方法。经过敏感性及特异性检测,该引物能与MEV标准株和地方分离株核酸发生特异性结合,扩增出一段长度为570bp的DNA片段,而与CDV、ADV等病毒的PCR反应均呈阴性。设计的该对引物可用于MEV的临床检测。

北极狐γ-干扰素cDNA的克隆、表达及活性测定

为研究狐γ-干扰素的生物学活性,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从北极狐外周血淋巴细胞中扩增出γ-干扰素(VuIFN-γ)cDNA。序列分析表明VuIFN-γcDNA全长501bp,编码23个氨基酸的信号肽和144个氨基酸的成熟肽蛋白,与已发表的银黑狐和犬IFN-γ核苷酸序列同源性为99.8%和99.4%;氨基酸同源性均为100%。应用原核表达系统高效表达北极狐γ-干扰素成熟肽蛋白,SDS-PAGE和Western blotting分析表达的融合蛋白分子量约为19kD,以不溶性的包涵体形式存在。重组蛋白经纯化和复性,在Vero和MDCK细胞上可明显抑制VSV病毒的复制,并测出北极狐重组γ-干扰素的活性单位分别为1.0×106u/mg和1.56×105u/mg,为进一步开发基因工程狐干扰素奠定基础。