促红细胞生成素促进内皮祖细胞增殖的体外研究及机制探讨

目的:研究人重组促红细胞生成素(rhEPO)对人内皮祖细胞(EPCs)数量和功能的影响并探讨其作用机制。方法:以不同浓度rhEPO分别作用于15例处于肾衰竭期的患者以及15例健康志愿者EPCs,MTT法检测其增殖,Annexin-V法检测其凋亡,Western blotting法检测Akt蛋白激酶。结果:100U/L、600U/L及1200U/L rhEPO均能提高实验组和对照组EPCs的数量及增殖能力,呈剂量依赖性,实验组EPCs数量及功能均显著低于对照组。1200U/L rhEPO能显著降低EPCs的凋亡率,提高Akt蛋白激酶的表达。加入Wortmannin后能阻断这一效应。结论:rhEPO可以显著提高健康人群和肾衰竭患者EPCs的数量与功能,且这一效应与PI3K/Akt信号通路有关。

人外周血来源内皮祖细胞诱导分化为心肌样细胞的实验研究及机制探讨

目的:研究人外周血来源内皮祖细胞(EPCs)在体外定向分化为心肌样细胞的能力及其可能机制。方法:分离培养及鉴定健康人群(对照组)及冠心病(CAD)患者(实验组)EPCs。将对照组及实验组EPCs分别分成3组在体外进行分化诱导实验:A组EPCs与乳鼠心肌共培养;B组EPCs与多聚甲醛固定后的乳鼠心肌共培养;C组于EPCs中加入收集到的乳鼠心肌培养液上清诱导培养。观察心肌样细胞形态变化;2周后免疫荧光法检测心肌肌钙蛋白(cTnT)和结蛋白(desmin)的表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测心肌相关基因ANP、cTnT、cTnI和主要组织相容性复合物α链(αMHC)的表达;流式细胞仪检测HLA-DR和人desmin的表达,计数desmin阳性表达细胞。结果:实验及对照A、B组EPCs均可呈现心肌样细胞形态;ANP、cTnT、cTnI和αMHC基因及cTnT和desmin蛋白均呈阳性表达;流式检测HLA-DR及desmin呈双阳性表达,对照A组分化率为(9±2)%,实验A组分化率约为(4±1)%,差异显著(P<0.01)。实验及对照C组EPCs形态未发生变化,各项检测指标均为阴性表达。结论:与乳鼠心肌共培养可诱导人外周血来源EPCs分化为心肌样细胞,且其可能机制为细胞间的直接接触。

他汀类药物和促红细胞生成素对人外周血内皮祖细胞数量和功能的影响

目的:观察他汀类药物和促红细胞生成素对外周血内皮祖细胞数量和迁移功能以及增殖功能的影响,并比较其作用效应。方法:实验于2004-06/2005-10在华中科技大学附属协和医院血研所实验室完成。采集来华中科技大学附属协和医院体检的正常人自愿者外周血标本36份,分离培养内皮祖细胞1周后,将贴壁细胞随机分成4组:①对照组:用含体积分数为0.02的胎牛血清M199培养基。②阿托伐他汀组:用1mmol/L阿托伐他汀处理培养基。③人重组促红细胞生成素组:用100IU/L人重组促红细胞生成素处理培养基。④联合组:用1mmol/L阿托伐他汀与100IU/L人重组促红细胞生成素联合处理培养基。培养24h后,检测并比较各组15个随机选择的×200视野的内皮祖细胞的数量,迁移能力以及增殖能力。结果:①内皮祖细胞数量:他汀组,促红细胞生成素组,联合用药组均较对照组有显著提高(P<0.01),他汀组和促红细胞生成素组间并无差异(P>0.05),而联合用药组与前三组相比均有显著性差异(P<0.01)。②内皮祖细胞迁移能力:他汀组,促红细胞生成素组,联合用药组均较对照组有显著提高(P<0.01),他汀组和促红细胞生成素组间并无差异(P>0.05),而联合用药组与前三组相比均有显著性差异(P<0.01)。③内皮祖细胞增殖能力:他汀组,促红细胞生成素组,联合用药组均较对照组有显著提高(P<0.01),他汀组和促红细胞生成素组间并无差异(P>0.05),而联合用药组与前三组相比均有显著性差异(P<0.01)。结论:他汀类药物阿托伐他汀和人重组促红细胞生成素均能在体外提高内皮祖细胞的数量,迁移能力以及增殖能力,且联合用药该效应更加明显。由于内皮祖细胞在心血管疾病的治疗中起着重要的作用,这两类药的联合应用将具有积极的临床意义。

高糖对糖尿病患者内皮祖细胞增殖凋亡的影响及其机制探讨

目的:了解葡萄糖对糖尿病患者内皮祖细胞(EPCs)增殖及凋亡的影响,并探讨其可能机制。方法:以不同浓度葡萄糖分别作用于25例正常人(对照组)和25例2型糖尿病患者(糖尿病组)EPCs,MTT法检测其增殖,Annexin-V/PI法检测其凋亡。RT-PCR法检测bcl-2和bax的表达水平。结果:33mmol/L葡萄糖使糖尿病组和对照组EPCs增殖率均减低,凋亡率增高;且能使糖尿病组和对照组EPCs表达bax增强,bcl-2表达无明显改变。而5mmol/L葡萄糖作用下糖尿病组和对照组EPCs增殖率、凋亡率及bax和bcl-2表达无明显改变。结论:高糖使EPCs增殖功能减弱,凋亡增加,bax表达增加可能是其机制之一。

糖尿病周围血管病血管内皮祖细胞数量和功能的改变及其机制探讨

糖尿病合并周围血管病患者内皮祖细胞数目减少,并与糖化血红蛋白水平呈负相关;增殖与黏附功能减低。糖尿病周围血管病变的发生可能与内皮祖细胞表达CXCR4减弱有关。

采用PCR-SSP方法检测强直性脊柱炎患者HLA-B27亚型

目的 建立序列特异性引物 聚合酶链方法 (PCR SSP)检测湖北地区人白细胞抗原B2 7(Humanleucocyteanti gen B2 7,HLA B2 7)阳性强直性脊柱炎患者的HLA B2 7亚型组成。方法 盐析法提取 10 0例HLA B2 7阳性的强直性脊柱炎患者外周血基因组DNA ,采用PCR SSP技术分别进行HLA B位点基因型检测和HLA B2 7基因亚型分析。结果 10 0例标本PCR SSP扩增均获成功 ,历时 3h。共检出 4种亚型 :HLA B 2 70 4、HLA B 2 711、HLA B 2 715、HLA B 2 72 2。其中HLA B 2 70 4纯合子 2 5例、HLA B 2 70 4杂合子 63例 ;HLA B 2 711杂合子 5例 ;HLA B 2 715杂合子 6例 ;HLA B 2 72 2杂合子 1例。四种亚型所占构成比分别为 90 4%、4%、4 8%和 0 .8%。结论 PCR SSP方法进行HLA B2 7亚型分析 ,快速、经济、简单 ;HLA B 2 70 4是湖北地区强直性脊柱炎患者HLA B2 7基因主要亚型。

心肌细胞裂解液诱导人脂肪基质干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的分离培养人脂肪基质干细胞(ASCs),观察心肌细胞裂解液诱导ASCs分化为类心肌细胞的情况。方法人脂肪组织用胶原蛋白酶Ⅰ消化,贴壁法培养获得ASCs,流式细胞术鉴定其表型,向ASCs培养体系中加入乳鼠心肌细胞裂解液,培养2周后,利用免疫荧光技术和RT-PCR法分析分化后细胞的心肌特异性蛋白和基因的表达情况。结果培养获得ASCs,表型为CD44+、CD105+、CD31-、CD45-。心肌细胞裂解液诱导培养2周后,细胞表达心脏特异性肌钙蛋白T(cTnT)、结蛋白,同时也表达心脏特异性基因cTnT、ANP、αMHC。结论心肌细胞裂解液可在体外诱导ASCs分化为类心肌细胞。

脂肪基质干细胞诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的研究脂肪基质干细胞(ASCs)的分离、纯化、扩增以及在体外定向分化为心肌样细胞的能力。方法获取并培养正常人的ASCs,倒置显微镜下观察其形态;流式细胞仪检测其免疫表型。5-氮胞苷诱导ASCs在体外分化为心肌样细胞,倒置显微镜观察心肌样细胞的形态,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测心肌相关基因ANP、cTnT、cT-nI和αMHC的表达;免疫荧光法检测cTnT和结蛋白的表达;Western blot法检测Connexin 43的表达。结果ASCs呈纤维样贴壁生长,体外培养易扩增;ASCs表达相关抗原CD29和CD105,不表达CD31、CD34、CD45和HLA-DR;ASCs经5-氮胞苷的作用可呈现典型的心肌样细胞形态,ANP、cTnT、cTnI和αMHC基因及cTnT、结蛋白和Connexin 43均呈阳性表达。结论脂肪组织中分离培养的ASCs具有体外大量扩增并保持低分化状态的特性,以及定向分化为心肌样细胞的能力,有望成为治疗心肌梗死的种子细胞。

人脂肪组织分离培养基质干细胞的方法及其表型鉴定

目的:分离培养人脂肪基质干细胞,鉴定其表型。方法:实验于2005-03/2005-12在华中科技大学同济医学院血研所实验室完成。脂肪组织取自华中科技大学同济医学院附属协和医院普通外科阑尾炎及腹股沟斜疝的14例手术患者,排除了冠心病、高血压病及糖尿病等。手术前均与本人谈话并征得其同意获取脂肪组织进行实验。分离人脂肪组织,胶原酶消化后制备细胞悬液并培养,消化传代以纯化细胞。传代的脂肪基质干细胞进行细胞生长曲线绘制,流式细胞术及免疫荧光法检测其表型。结果:14份标本均成功培养出脂肪基质干细胞并生长良好,平均传至20～25代。①原代细胞培养72h后可见细胞贴壁,5d后可见细胞呈纺锤形、多角形改变,9d后细胞生长明显增加,排列密集并呈涡旋状生长,随着培养时间的延长,梭形细胞逐渐占据优势。到第12天后可见细胞铺满瓶底80%。传代后细胞增殖速度明显加快,于第3天开始数量明显增多,五六天后细胞即已长满培养瓶底,融合成片状,细胞排列更加整齐有序。多次传代后细胞呈更均匀有序的分布。②脂肪基质干细胞倍增时间约为48h。③第5代的脂肪基质干细胞细胞表型,呈CD31-,CD34-,CD45-,HLA-DR-,CD29+,CD105+。④免疫荧光法鉴定脂肪基质干细胞表达CD13和CD44。结论:本实验成功从人脂肪组织中分离培养出基质干细胞,通过流式细胞术和免疫荧光检测,培养后的细胞表达CD13、CD29、CD44、CD105,而不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR。

内皮祖细胞和单个核细胞移植对糖尿病大鼠血管病变疗效的比较

目的比较内皮祖细胞(EPC)和单个核细胞(MNC)移植改善糖尿病大鼠后肢血管病变的疗效。方法将大鼠EPC和外周血MNC标记后分别植入糖尿病大鼠缺血后肢。对照组仅植入PBS溶液。ELISA法检测VEGF的含量,免疫组化法计数毛细血管数目。结果EPC和MNC均能在缺血后肢分化为毛细血管。移植后EPC组和MNC组大鼠缺血肢体局部VEGF含量高于对照组,毛细血管数目也高于对照组。但EPC组和MNC组VEGF含量和毛细血管数目无明显差异。结论移植EPC及含有相当数量EPC的MNC对糖尿病大鼠后肢血管病变的改善作用相似。EPC可能在外周血单个核细胞移植中发挥主要作用。

雌激素对糖尿病患者内皮祖细胞数量和功能的影响

目的:观察雌激素对2型糖尿病患者外周血内皮祖细胞数量和功能的改变,并检测趋化因子受体CXCR4的表达。方法:实验于2005-02/09在华中科技大学同济医学院附属协和医院完成。选取武汉市中心医院收治的20例2型糖尿病患者,均根据1999年中国糖尿病学会新的诊断标准确诊。①抽取2型糖尿病患者外周静脉血,常规密度梯度离心法获取单个核细胞,进行内皮祖细胞的分离培养。加入雌二醇培养3d,按其浓度分为雌激素0nmol/L组、雌激素50nmol/L组、雌激素100nmol/L组。②检测内皮祖细胞的生长增殖和凋亡情况,测定其黏附能力。分别以反转录-聚合酶链法及流式细胞术对内皮祖细胞表达CXCR4的水平进行检测。结果:按意向处理分析,实验选取20例2型糖尿病患者血样全部进入结果分析。①内皮祖细胞的培养、鉴定及计数情况:培养4d后可见贴壁的单个核细胞,7d后细胞变为梭形,并慢慢变长。流式细胞仪鉴定细胞表型,可见内皮祖细胞大多表达CD34,且60%～80%表达CD133。对贴壁细胞行荧光染色后,>80%的细胞双染色阳性,可认为是正在分化的内皮祖细胞。计数结果显示,随着加入雌激素浓度的增加,各组内皮祖细胞数量差异具有显著性意义(P<0.05)。②内皮祖细胞增殖及凋亡的检测结果:各组内皮祖细胞增殖率基本相似(P>0.05)。随着雌激素浓度的增加,雌激素0nmol/L组、雌激素50nmol/L组、雌激素100nmol/L组的凋亡率呈下降趋势,差异有显著性意义(P<0.05)。③内皮祖细胞黏附能力检测结果:各组内皮祖细胞黏附能力基本相似(P>0.05)。④CXCR4在内皮祖细胞上的表达情况:流式细胞术检测各组内皮祖细胞上CXCR4的表达阳性率,可见随着雌激素浓度增加,各组CXCR4表达率也随之增加,差异具有显著性意义(P<0.05)。反转录-聚合酶链反应法检测CXCR4的表达,亦得到相似结果。结论:雌激素对2型糖尿病患者内皮祖细胞的数量及功能均产生影响,可明显抑制内皮祖细胞凋亡及上调CXCR4的表达。提示雌激素可能在防止糖尿病周围血管病变上发挥一定作用。

内皮祖细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死的实验研究

目的探讨大鼠内皮祖细胞(EPCs)移植于梗死心肌的增殖分化情况及对心功能的影响。方法分离培养大鼠EPCs,免疫荧光法检测其CD34+、CD133+和Flk-1+的表达。将SD大鼠冠状动脉左前降支结扎制造急性心肌梗死模型后,在梗死心肌处植入DAPI标记的EPCs(实验组)或M 199培养液(对照组)。移植后1周及4周,心脏超声检查心功能,并对梗死区心肌组织进行移植细胞形态学检查及毛细血管密度测定,逆转录聚合酶链反应及酶联免疫吸附测定梗死周边区血管内皮生长因子(VEGF)的表达。结果培养获得EPCs,其表型为CD34+、CD133+和Flk-1+。植入梗死区的EPCs可以分化为血管内皮细胞,实验组梗死心肌处血管密度较对照组明显增高(P<0.01),并且VEGF基因及蛋白表达在移植后1周均较对照组明显增高(P<0.01)。移植后4周,实验组大鼠左心室射血分数及左心室短轴缩短率较对照组明显提高(P<0.01);而移植后1周,两组大鼠超声检测心功能各指标变化不明显。结论同种异体EPCs移植到梗死心肌大鼠缺血心肌能分化为毛细血管内皮细胞,促进梗死后心肌血管新生,改善心功能。

胰岛素自身免疫综合征1例诊治报告及文献复习!

胰岛素自身免疫综合征（insulin autoimmune syndrome,IAS）,又称Hirata病,由Hirata于上世纪70年代首次报道,是由血中非外源性胰岛素诱导的高浓度免疫活性胰岛素（immunoreactive insulin,IRI）及高滴度的胰岛素自身抗体（insulin autoantibody,IAA）所引起的反复自发性低血糖症,是一种少见的自身免疫性内分泌疾病，临床上易与其他原因诱发的低血糖相混淆。

人外周血内皮祖细胞的分离培养及鉴定

目的:从人外周血中分离培养内皮祖细胞(EPCs),并探讨其体外诱导培养的条件。方法:密度梯度离心法分离正常人外周血单个核细胞,置于鼠尾胶原包被的培养瓶中进行体外培养,流式细胞术和免疫荧光法检测分化细胞表面特异性抗原标记物的表达。结果:人外周血单个核细胞在鼠尾胶原包被的培养瓶中培养后呈梭形,并表达内皮细胞的特异性抗原CD34和KDR,和干/祖细胞抗原CD133。提示这些培养细胞既具有内皮细胞的表面标志和功能,又具有祖细胞特性。结论:成功从外周血中培养出EPCs。鼠尾胶原可取代EPCs培养中常用的纤维连接蛋白,是体外分离培养外周血EPCs的更节省的一种方法。

重组人促红细胞生成素对糖尿病肾病患者内皮祖细胞的影响及机制探讨

目的研究重组人促红细胞生成素（rhEPO）对糖尿病肾病患者内皮祖细胞（EPCs）数量与功能的影响，并探讨其作用机制。方法以不同浓度（0．3、0.6、1．2kU／L）rhEPO分别作用于20例健康人（对照组）及20例糖尿病肾病患者（DN组）EPCs，二苯基四氮唑溴盐（MTT）法检测其增殖，Annexin—V碘化丙啶法检测其凋亡，Westernblot法检测Akt蛋白激酶的表达。结果不同浓度rhEPO均能提高对照组和DN组EPCs的数量及增殖能力，呈剂量依赖性，但对DN组作用更显著。1．2kU／LrhEPO能显著降低DN组EPCs的凋亡率，提高Akt蛋白激酶的表达。加入Wortmannin后能阻断这一效应。结论rhEPO能提高糖尿病肾病患者EPCs的数量与功能，且这一效应与PI3K／Akt信号途径有关。

脂肪基质干细胞对异基因T淋巴细胞的作用及机制探讨

目的:研究脂肪基质干细胞(ASC)对异基因T淋巴细胞的作用,探讨ASC发挥免疫调节作用的方式和可能机制。方法:将ASC上清和ASC分别与异基因T淋巴细胞进行混合培养。MTT法检测T细胞的增殖,AnnexinⅤ法检测凋亡,流式细胞术检测T细胞中CD4+CD25+细胞的比例,ELISA法检测T细胞分泌IL-10和TGF-β1的水平,RT-PCR法检测Foxp3基因的表达。结果:ASC上清对T淋巴细胞的增殖和凋亡无明显影响。ASC对T淋巴细胞的生长有抑制作用,但对其凋亡无影响。ASC上清和ASC均能增加CD4+CD25+T细胞在T淋巴细胞中的比例,增加T细胞分泌IL-10和TGF-β1的水平,上调Foxp3基因的表达。结论:ASC能通过细胞直接接触和分泌细胞因子的方式分别作用于T淋巴细胞,发挥免疫负调节作用。

辛伐他汀对2型糖尿病患者内皮祖细胞增殖的影响及其机制探讨

目的观察辛伐他汀对2型糖尿病患者外周血来源内皮祖细胞（EPCs）增殖的影响，并初步探讨其机制。方法2型糖尿病合并高脂血症患者20例，随机分为辛伐他汀组（给予辛伐他汀20mg/d口服）和对照组（给予安慰剂）。治疗前及治疗后2、4周取外周血获取单个核细胞，培养7d后对获得的细胞进行分析，比较各组EPCs数目，并对血清中低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）浓度与EPCs数目的改变进行相关分析。在EPCs培养体系中分别加入辛伐他汀、磷脂酰肌醇-3激酶，蛋白激酶通路（P13K／Akt）信号转导特异性抑制荆Ly294002。观察对其增殖的影响。结果辛伐他汀组患者治疗后2、4周外周血中EPCs明显增多（P〈0．01），其变化与LDL-C变化无相关性（P〉0．05）。体外实验证明辛伐他汀能促进EPCs的增殖，这种作用能被Ly294002阻断。结论辛伐他汀能促进EPC8的增殖，这种作用可能与激活P13K／Akt信号转导通路有关。

抗利尿激素不适当分泌综合征2例报道及文献复习

抗利尿激素不适当分泌综合征(syndrome of inappropriate antidiuretic hormone secretion,SIADH)又称Schwartz-Bartter综合征,由Schwartz等[1]于1957年首先报道,是由于抗利尿激素(antidiuretic hormone,ADH)过量分泌导致体内水潴留、稀释性低钠血症、尿钠与尿渗透压升高的临床综合征[2]。

达格列净致非高血糖性糖尿病酮症酸中毒1例报告及诊疗体会

钠-葡萄糖转运蛋白2(sodium-glucose cotransporter 2,SGLT2)抑制剂是一类不依赖于胰岛素的新型口服降糖药物,包括达格列净、恩格列净及卡格列净^([1])。SGLT2抑制剂通过减少肾近曲小管对葡萄糖的重吸收,增加尿糖排泄,从而降低血液中葡萄糖水平^([2])。国内外报道发现,使用SGLT2抑制剂降血糖的患者有发生糖尿病酮症酸中毒(diabetic ketoacidosis,DKA)的风险,且以非高血糖性糖尿病酮症酸中毒(euglycemic diabetic ketoacidosis,euDKA)为其非典型性特征^([3])。2015年美国食品药品监督管理局(Food and Administration,FDA)2次针对SGLT2抑制剂诱发酮症酸中毒做出警告。《2019国际共识:SGLT抑制剂治疗的1型糖尿病患者DKA风险管理》提出使糖尿病酮症酸中毒最小化的建议^([4])。本文报道1例达格列净引起的euDKA,并对其临床特点进行分析。

阿德福韦酯致低磷骨软化症1例的诊疗体会

低磷骨软化症是由于低磷血症造成的骨基质不能正常矿化的代谢性骨病,临床上较少见。病因主要分为遗传性、肿瘤性、肾性及药源性。早期诊断不易,极易误诊。本文结合1例长期服用阿德福韦酯引起低磷骨软化症患者病历资料,讨论其临床表现、诊断、治疗方案及预后,为广大医生正确认识该病提供一定的帮助。