限制性内切酶DpnⅡ及其硒代衍生物的制备

来源于肺炎双球菌Diplococcus pneumoniae的Ⅱ型限制性内切酶DpnⅡ是分子生物学领域中常用的一种工具酶,它在基因工程等领域发挥着重要作用,目前其三维结构尚未被解析。为了解析DpnⅡ的蛋白结构,进一步阐明DpnⅡ的分子机制,构建了pET28b-DpnⅡ重组表达载体,并采用大肠杆菌表达系统,利用BL21(DE3)pLysS菌株高效表达了DpnⅡ及其硒代衍生物,经Ni亲和层析、阴离子交换、凝胶过滤层析、肝素亲和层析等4步纯化获得了纯度在95%以上的重组蛋白和硒代蛋白,质量浓度均为10 mg/mL,产量分别为6.5 mg/L和5.5 mg/L。酶活研究发现,硒代蛋白和重组蛋白对底物pUC19质粒切割产生了大小一致的条带,表明硒代蛋白的活性未受到明显影响。

限制性内切酶NcoⅠ的高效重组表达、硒代与结晶条件初步筛选

来源于珊瑚诺卡氏菌Nocardia corallina的限制性内切酶NcoⅠ是基因工程中常用的工具酶之一。然而目前NcoⅠ蛋白质三维结构尚未被解析,对其基因改造缺乏理论指导。为了解析NcoⅠ的三维结构,采用大肠杆菌表达系统,高效重组表达和纯化,获得了纯度>95%的NcoⅠ野生型和Se-NcoⅠ硒代蛋白。质谱分析表明,重组Se-NcoⅠ蛋白中所有硫原子成功被硒原子取代。酶切实验表明,硒代蛋白与野生型具有相似的限制酶活性。采用坐滴法筛选重组NcoⅠ蛋白结晶条件,已在3种条件下获得针状晶体,1种条件下获得颗粒状晶体。X射线衍射初步分析晶体分辨率在0.8 nm左右,为下一步解析NcoⅠ三维结构提供了基础。

一种快速精确测定Tth DNA聚合酶活性的方法

Tth DNA聚合酶是一种同时具备DNA聚合酶和逆转录酶活性的耐热型工具酶,但在生产和改造过程中,缺乏准确、快速、简便测定酶活的方法。利用高灵敏度双链特异性核酸染料PicoGreen和特殊设计的发夹型探针,建立了一种测定Tth DNA聚合酶活性的新方法。该方法的标准曲线线性关系良好,决定系数R^(2)达到0.99以上,灵敏度和准确度高,操作简单,测定结果与商业化产品标定的活力相符,经荧光定量PCR验证能够反映真实使用环境下的酶活。该方法还可推广到测定其他DNA聚合酶活性,将为DNA聚合酶的生产和改造提供有效的检测手段。

限制性内切酶Mlu Ⅰ蛋白及其硒代衍生物的制备

【背景】限制性内切酶Mlu Ⅰ是一种常用的工具酶,在分子生物学领域发挥着重要的作用,其三维结构尚未被解析。【目的】在大肠杆菌中克隆表达、纯化重组Mlu Ⅰ蛋白及其硒代蛋白,并进行结晶条件的研究。【方法】构建重组表达载体pET28b-Mlu Ⅰ,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达,利用亲和层析和凝胶过滤层析纯化重组Mlu Ⅰ蛋白和硒代Mlu Ⅰ蛋白。对蛋白进行质谱检测、圆二色谱检测以及酶活检测,利用坐滴法进行结晶条件的筛选。【结果】构建了重组表达载体pET28b-Mlu Ⅰ并纯化获得达到结晶纯度的蛋白,通过质谱检测确定硒代Mlu Ⅰ蛋白中的8个甲硫氨酸全部被取代,结合酶活测试及圆二色谱检测确定了硒代对Mlu Ⅰ蛋白的活性、结构无明显影响。采用坐滴法进行初步的晶体生长研究,重组蛋白目前已在1种条件下获得针状晶体并进行初步衍射,获得分辨率在0.32 nm左右的衍射数据。【结论】Mlu Ⅰ蛋白及硒代Mlu Ⅰ蛋白纯化体系的构建和结晶条件的研究,可为下一步解析Mlu Ⅰ三维结构、作用机制的探讨及定向改造奠定基础。