microRNA-29b在血管紧张素Ⅱ诱导肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的:研究microRNA-29b(miR-29b)在血管紧张素Ⅱ诱导肾小管上皮细胞间充质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的角色。方法:实时定量PCR检测自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)和Wistar-Kyoto(WKY)大鼠肾脏皮质组织miR-29b表达的差异。体外培养NRK-52E大鼠肾小管上皮细胞,给予血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)10-7mol/L(为Ang Ⅱ组),以正常培养的细胞作空白对照,实时定量PCR检测Ang Ⅱ组和正常对照组细胞miR-29b表达差异,运用WesternBolt技术和实时定量PCR技术分别检测Ang Ⅱ组和空白对照组TGF-β、α肌动蛋白(α-SMA)和I型胶原蛋白(Col Ⅰ)的表达量。进一步分别再转染miR-29b inhibitor和miR-29b mimics,建立miR-29b低表达和高表达细胞模型。低表达模型实验分三组:①空白对照组:正常培养的肾小管上皮细胞未经任何处理;②低表达组:转染miR-29b inhibitor;③阴性对照组:转染随机合成NC microRNA片段。高表达模型实验分三组:①空白对照组:肾小管上皮细胞给予Ang Ⅱ(10-7mol/L)诱导;②高表达组:肾小管上皮细胞给予Ang Ⅱ(10-7mol/L)诱导,同时转染miR-29b mimcs;③阴性对照组:肾小管上皮细胞给予Ang Ⅱ(10-7mol/L)诱导,同时转染随机合成NC microRNA片段。用流式细胞仪技术检测转染率,用实时定量PCR检测转染效果,运用Western Bolt技术和实时定量PCR技术分别检测各组中TGF-β、α-SMA和Col Ⅰ的表达量。结果:实时定量PCR检测SHR大鼠肾脏皮质组织miR-29b的表达(0.76±0.01)相比WKY大鼠(1.00±0.00)下降(P<0.05),相比空白对照组(1.00±0.00),Ang Ⅱ组miR-29b的表达(0.56±0.06)明显下降(P<0.05),TGF-β、α-SMA、Col Ⅰ的mRNA表达和蛋白表达明显升高(P<0.05)。流式细胞仪技术检测NRK-52E细胞转染率为95.14%,相比空白对照组(1.00±0.00),低表达组miR-29b表达(0.07±0.02)明显下降,高表达组miR-29b表达(38.3±8.1)明显升高(P<0.05)。在低表达模型实验中,低表达组α-SMA、TGF-β、Col Ⅰ mRNA表达和蛋白表达比空白对照组和阴性对照组均上调(P<0.05),而空白对照组和阴性对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。在高表达模型实验中,高表达组的NRK-52E细胞α-SMA、TGF-β、Col Ⅰ的mRNA表达和蛋白表达比空白对照组和阴性对照组均下调(P<0.05),而空白对照组和阴性对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:SHR大鼠肾脏皮质组织miR-29b的表达水平比WKY大鼠下降,这可能和SHR大鼠体内的高Ang Ⅱ水平有关,miR-29b表达降低能促进肾小管上皮细胞发生EMT,Ang Ⅱ调节肾小管上皮细胞发生EMT的一个潜在的机制可能是通过miR-29b来实现的。

与肾小管上皮转分化相关的miRNA的初步筛选

目的观察miRNA在大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)发生上皮-肌成纤维细胞转分化(EMT)过程中的变化,筛选与肾小管上皮细胞转分化相关的miRNA。方法体外培养NRK-52E,用5 ng/ml转化生长因子-13 1(TGF-13 1)分别作用0、3、6、12、24、48 h,以0 h为空白组(BC组),余为TGF-β1组。倒置相差显微镜观察细胞形态学变化;real-time PCR法检测细胞内α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E钙蛋白(E-cad)、1型胶原(Col 1)和纤连蛋白(FN)的mRNA表达水平;Western blot法检测细胞内α-SMA的表达水平;ELISA法检测上清液中FN的含量;茎环实时荧光定量PCR法检测6条miRNA在细胞内的表达水平。结果与BC组比较,TGF-β1组部分细胞失去原有的鹅卵石形态,转变成成纤维细胞特有的梭形;细胞内α-SMA、Col I和FN的mRNA表达上调,E-cad的mRNA表达下调,细胞内α-SMA表达量增多,细胞上清液中FN含量升高(均P<0.05);miR-30d、miR-132和miR-21的表达上调,miR-200b、miR-192和miR-10b的表达下调(均P<0.05)。结论 TGF-β1可诱导NRK-52E发生EMT。miR-30d、miR-132、miR-21、miR-200b、miR-192和miR-10b可能参与大鼠肾小管上皮细胞EMT,值得进一步研究。

98例特发性局灶节段性肾小球硬化的临床病理分析

目的:探讨温州地区特发性局灶节段性肾小球硬化(FSGS)的临床病理及流行病学特点。方法:对1993年2月～2007年9月间经我院肾内科病理室诊断的98例特发性FSGS进行回顾性总结,分析其临床表现、肾活检组织形态学及流行病学特点,进行临床与病理联系分析。结果:(1)98例特发性FSGS以20岁～45岁为发病高峰年龄(占59.1%),占同期原发性肾小球疾病的3.6%及原发性肾病综合征的4.3%。(2)临床表现以肾病综合征(NS)最常见,占43例(43.9%),发病时常并发高血压(49.0%)和慢性肾衰竭(35.7%)。肾衰竭组的肾病范围蛋白尿发生率、高血压的发生率及血尿酸水平明显高于肾功能正常组(P<0.05)。(3)主要病理特征:76.5%患者伴有不同程度的肾小球球性硬化,其中球性硬化比例≥25%者占36.7%;82.7%患者伴不同程度的慢性肾小管间质病变,其中Ⅱ～Ⅲ级占15.3%。肾衰竭者Ⅱ～Ⅲ级肾小管间质病变比例较肾功能正常者高(28.6%vs10.0%,P<0.05)。(4)肾小球球性硬化的比例与血清肌酐值、病程及年龄呈正相关(P<0.05),肾小管间质病变程度与Ccr呈负相关(P<0.05)。球性硬化比例与肾小管间质病变程度呈正相关(P<0.01)。结论:特发性FSGS在占本地区同期肾活检原发性肾小球疾病的3.6%,该病常并发高血压和慢性肾衰竭,病理上常见明显的肾小球球性硬化及慢性肾小管间质损害,慢性肾小管间质病变是影响患者预后的重要因素。

Klotho通过抑制氧化应激对肾小管上皮细胞低氧/再氧化损伤的影响

目的探讨Klotho蛋白对肾小管上皮细胞低氧/再氧化损伤的保护机制。方法体外培养小鼠近端肾小管上皮细胞(TCMK-1),根据是否给予低氧/再氧化刺激及Klotho蛋白干预分为对照组(无干预),低氧/再氧化损伤组(低氧24 h后再复氧不同时间),低氧/再氧化+Klotho干预组(给予Klotho蛋白预处理1 h后,低氧24 h后再复氧8 h)。Western blot法检测细胞Klotho蛋白的表达;Cyto Tox-ONETM法检测细胞乳酸脱氢酶(LDH)的释放水平,评估细胞损伤程度;DCFH-DA探针检测细胞内活性氧(ROS)水平。结果低氧/再氧化损伤组LDH释放率高于对照组,低氧/再氧化+Klotho治疗组LDH释放率低于低氧/再氧化损伤组(P <0.05)。同时,低氧/再氧化损伤组ROS水平高于对照组,低氧/再氧化+Klotho治疗组ROS水平低于低氧/再氧化损伤组(P <0.05)。结论 Klotho对肾小管上皮细胞低氧/再氧化损伤的保护作用可能与其抗氧化应激的作用机制相关。

以反复乏力、高钙血症、肾功能损害、T细胞斑点检测阳性为主要表现的结节病1例

结节病与结核病同属于肉芽肿类疾病,二者临床表现相似,临床鉴别存在一定困难。结节病需要应用糖皮质激素治疗,而结核病患者使用激素可导致疾病的播散与复发。杭州市第一人民医院曾收治1例以反复乏力、双下肢麻木、消瘦、夜尿增多为主要症状的患者,反复血钙、Scr升高,外院多次诊断结核病,进行抗结核治疗后症状未缓解并呈进行性加重;肾内科以反复高钙血症为切入点.