Kv1.5蛋白在内毒素致血管内皮细胞损伤中的作用机制

目的研究Kv1.5蛋白在内毒素致血管内皮细胞损伤中的作用机制。方法体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),给予脂多糖(LPS)刺激建立脓毒症模型,并分为:空白对照组、LPS组、LPS+Kv1.5蛋白通道特异性阻滞剂MT1(250nmol/L)组及LPS+MT2(500nmol/L)组,DAPI染色免疫荧光观察各组HUVECs凋亡情况,Western blot检测Caspase-3及Bcl-2蛋白的表达,RT-PCR检测Caspase-3及Bcl-2基因的表达。结果 DAPI染色免疫荧光显示,LPS组内皮细胞核固缩、凋亡小体形成,凋亡小体形成率由空白对照组的(4.2±0.7)%增加至(26.7±0.8)%(P<0.01),而250nmol/L、500nmol/L MT预处理后,凋亡小体形成率从LPS组(26.7±0.8)%分别下降至(12.4±1.0)%、(8.5±0.9)%(均P<0.01);Western blot检测结果显示,LPS组较空白对照组Bcl-2蛋白表达减少、Caspase-3蛋白表达增加(均P<0.01),给予500nmol/L MT预处理后,与LPS组比较,Bcl-2蛋白表达上调、Caspase-3蛋白表达下调(均P<0.01);RT-PCR检测结果显示,LPS组较空白对照组Bcl-2mRNA表达下调、Caspase-3mRNA表达上调(均P<0.01),给予500nmol/L MT预处理后,与LPS组比较,Bcl-2mRNA表达上调、Caspase-3mRNA表达下调(均P<0.01)。结论Kv1.5介导脓毒症相关内皮细胞损伤可能与线粒体凋亡途径有关。

骨髓间充质干细胞通过调控miR-142-3p保护LPS诱导大鼠肺上皮细胞RLE-6TN的炎症损伤与凋亡

目的:研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)对脂多糖(LPS)介导的大鼠肺上皮细胞RLE-6TN炎症损伤与凋亡的作用及其可能机制。方法:CCK8法筛选LPS干预大鼠肺上皮细胞RLE-6TN的浓度与时间,qPCR检测细胞miR-142-3p表达水平。将RLE-6TN细胞分为6组:对照组、LPS组、BMSCs培养液(DMEM/F12)组、RLE-6TN+BMSCs 1组(RLE-6TN∶BMSCs=10∶2共培养)、RLE-6TN+BMSCs 2组(RLE-6TN∶BMSCs=10∶3共培养)和RLE-6TN+BMSCs 3组(RLE-6TN∶BMSCs=10∶4共培养)。流式检测RLE-6TN细胞凋亡,qPCR检测RLE-6TN细胞miR-142-3p、IL-6及TNF-αmRNA表达水平,Western blot检测细胞Bcl-2和caspase-3蛋白表达水平。结果:经LPS诱导后,RLE-6TN细胞凋亡率显著升高(P<0.05),miR-142-3p、IL-6、TNF-αmRNA及caspase-3蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),而Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)。与LPS组比较,RLE-6TN+BMSCs组RLE-6TN细胞凋亡率降低(P<0.05),miR-142-3p、IL-6、TNF-αmRNA及caspase-3蛋白表达显著降低(P<0.05),Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05),且随着BMSCs共培养比例越大,变化越明显(P<0.05)。结论:BMSCs与大鼠肺上皮细胞RLE-6TN共培养,可减轻LPS介导的细胞炎症损伤及凋亡,其作用机制可能与抑制miR-142-3p表达有关。

柚皮素对缺氧损伤大鼠心肌细胞的保护作用

目的探究柚皮素对缺氧损伤的大鼠心肌细胞是否有保护作用。方法用大鼠心肌细胞系H9c2细胞制备心肌细胞缺氧损伤模型,并用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒进行模型鉴定。实验分为5组:对照组,模型组,以及柚皮素低、中、高剂量组(20、40、80μmol/L)。用CCK-8检测细胞增殖抑制率,间接免疫荧光法检测细胞肥大状况,流式细胞术检测细胞凋亡水平,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-2关联X蛋白(Bax)、caspase 3的表达水平,qRT-PCR检测血管内皮细胞生长因子(VEGF)、NK2型同源异形框基因5(Nkx2.5)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA表达水平。结果模型组细胞培养上清中LDH活性高于对照组(P<0.01),表明缺氧损伤心肌细胞建模成功。柚皮素各剂量组细胞增殖抑制率均低于模型组(P<0.05、P<0.01)。与模型组比较,柚皮素各剂量组H9c2心肌细胞肥大状况有所缓解(P<0.05、P<0.01)。柚皮素中、高剂量组凋亡细胞比例均较模型组降低(P均<0.01)。与模型组比较,柚皮素各剂量组凋亡蛋白caspase 3、Bax表达均降低,凋亡抑制蛋白Bcl-2表达均升高(P<0.05、P<0.01)。与模型组比较,柚皮素高剂量组Nkx2.5 mRNA表达水平升高(P<0.01),柚皮素中、高剂量组VEGF mRNA表达水平均升高(P<0.05、P<0.01),柚皮素各剂量组α-SMA mRNA表达水平均降低(P均<0.01)。结论柚皮素对缺氧损伤的大鼠心肌细胞有保护作用。

Kv1.5蛋白对内毒素致血管内皮细胞氧化应激损伤的影响

目的研究Kv1.5蛋白对内毒素(LPS)所致血管内皮细胞氧化应激损伤的影响。方法体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),给予5μg/mL LPS刺激建立脓毒症细胞模型,并分为:空白对照组、LPS组、LPS+MT1组(以Kv1.5特异性通道阻滞剂MT 250nmol/L预处理30min)及LPS+MT2组(MT浓度为500nmol/L)。采用MTT法检测内皮细胞存活率;ELISA法检测细胞上清液中内皮细胞E-选择素(E-selectin)、细胞间粘附分子(ICAM-1)浓度变化;激光共聚焦显微镜观察内皮细胞内ROS水平;比色法检测脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果与空白对照组比较,LPS组内皮细胞存活率明显下降[(32.54±1.87)%vs.(98.64±0.92)%,P<0.01],而LPS+MT1组及LPS+MT2组内皮细胞存活率分别为(77.39±1.15)%、(93.22±1.15)%,均较LPS组上升(均P<0.01);LPS组内皮细胞E-selectin、ICAM-1分泌增加(均P<0.01),予以250、500nmol/L MT预处理后,E-selectin、ICAM-1分泌减少(均P<0.01);激光共聚焦显微镜观察内皮细胞内ROS水平发现,LPS组细胞内ROS水平升高为空白对照组的(3.39±0.42)倍(P<0.05),予以250、500nmol/L MT预处理后,ROS水平分别为空白对照组的(1.88±0.36)倍、(1.46±0.47)倍,与LPS组比较,差异有统计学意义(均P<0.05);且LPS组较空白对照组MDA水平上升、SOD活性降低(均P<0.01),而MT预处理可降低MDA含量、增加SOD活性(均P<0.01)。结论 Kv1.5蛋白与内毒素诱导的血管内皮细胞损伤密切相关;MT通过阻断Kv1.5通道可减轻内皮细胞脂质过氧化损伤。

GDF3通过NRF2/GPX4调控铁死亡减轻脓毒症急性肺损伤

目的:探讨生长分化因子3(GDF3)通过调控铁死亡减轻小鼠脓毒症急性肺损伤的作用机制。方法:雄性C57BL/6小鼠30只,随机分成Control组、CLP组、CLP+GDF3组,每组各10只。采用盲肠结扎穿孔法(CLP)制备脓毒症肺损伤小鼠模型,CLP+GDF3组在CLP造模前尾静脉注射GDF3重组蛋白(20μg/kg)。造模24 h后取材,HE染色观察肺组织病理形态并评分,计算肺组织湿重干重比;瑞氏-吉姆萨染色分类计数各组小鼠肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞数量,ELISA法检测各组小鼠血清及BALF中炎性细胞因子TNF-α与IL-1β水平和肺组织中MDA、GSH与Fe^(2+)水平,q-PCR与Western Blot法检测肺组织中GPX4、HO-1、NRF2 mRNA与蛋白质表达水平,免疫组化与免疫荧光染色检测GPX4蛋白表达。结论:与Control组相比,CLP组、CLP+GDF3组肺组织损伤明显加重,肺湿/干重比明显升高,BALF中炎性细胞数目增加,血清及BALF中TNF-α及IL-1β水平升高,肺组织中MDA与Fe^(2+)含量增加,GSH含量降低,肺组织GPX4、HO-1与NRF2 mRNA与蛋白水平表达水平降低(P<0.05);与CLP组相比,CLP+GDF3组肺组织损伤明显减轻,肺湿/干重比下降,BALF中炎性细胞减少,血清及BALF中TNF-α及IL-1β水平下降,肺组织中MDA与Fe^(2+)含量减少,GSH含量增加,肺组织GPX4、HO-1与NRF2在mRNA与蛋白水平表达升高(P<0.05)。结论:GDF3可以减轻脓毒症小鼠急性肺损伤,作用机制可能与激活NRF2/GPX4信号通路、抑制铁死亡相关。

柚皮素对LPS致心肌细胞损伤炎症及氧化应激的保护作用

为探索柚皮素对LPS致心肌细胞损伤炎症及氧化应激的保护作用,以10μg/mL的LPS建立H9c2细胞损伤模型,并将细胞分为对照组、LPS组、柚皮素低剂量组(20μmol/L)、柚皮素中剂量组(40μmol/L)和柚皮素高剂量组(80μmol/L)。以CCK-8方法检测细胞活性;ELISA检测细胞肌酸激酶(creatine kinase,CK)、乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平;FACS检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;PCR检测IL-6、IL-1β、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1,MCP-1)、TNF-α、细胞间黏附分子(intercellular cell adhesion molecule,ICAM)、血管细胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule,VCAM)mRNA的表达水平。结果显示,与LPS组比较,柚皮素处理后的细胞活性显著升高(P<0.05),CK、LDH、MDA、ROS水平以及IL-6、IL-1β、MCP-1、TNF-α、ICAM、VCAM mRNA表达水平显著降低(P<0.05),SOD水平显著升高(P<0.05),且呈剂量依赖性。该研究提示,柚皮素可减少LPS诱导的心肌细胞产生ROS,降低其炎症反应,并增加细胞的活性。

调节性树突状细胞在急性呼吸窘迫综合征免疫治疗中的应用

目前针对急性呼吸窘迫综合征(ARDS)失控炎症反应的免疫治疗仍未取得临床效果,调节性树突状细胞由于其负向免疫调节作用可能为ARDS的免疫治疗提供新的思路和手段。