WT1多肽乳佐剂疫苗的免疫增强效应及其对急性髓系白血病抗肿瘤效应研究

目的 评价Wilm瘤基因1(Wilms’ tumor gene1, WT1)多肽联合AddaVax^(TM)乳佐剂疫苗的稳定性、安全性、免疫增强效应及其对急性髓系白血病抗肿瘤效应。方法 用MALDI-TOF-MS飞行时间质谱评价该佐剂疫苗中WT1多肽的稳定性;将C57BL/6雌性小鼠按照随机数字表法分成3组:PBS组、WT1组和WT1+AddaVax^(TM)组,使用免疫剂量为抗原50μg/只、佐剂50μg/只,按照第0、14、28天肌肉注射免疫程序进行免疫。用HE染色评价疫苗肌肉注射小鼠脏器组织毒性;用ELISA检测细胞因子水平;ELISpot检测脾细胞分泌IFN-γ细胞数量;流式细胞术检测疫苗促体外骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells, BMDCs)成熟和促淋巴细胞活化及H-2Db WT1四聚体检测特异性CD8+T细胞比例;用C1498-mWT1稳转细胞株构建小鼠白血病肿瘤模型后,评价其预防与治疗的抗肿瘤效应。结果 WT1多肽可在疫苗中稳定存在,对小鼠肌肉注射未发生明显的脏器组织变化;对小鼠肌肉注射WT1+AddaVax^(TM)疫苗后,与WT1组相比,WT1+AddaVax^(TM)组可诱导高水平的Th1细胞免疫应答γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及其Th17免疫应答白介素17A(IL-17A)(P<0.05);与WT1组相比,WT1+AddaVax^(TM)组促进脾淋巴细胞分泌IFN-γ的细胞数量增加(P<0.01),促进BMDCs成熟的标志物CD40^(+)/CD11c^(+)、CD86^(+)CD80^(+)/CD11c^(+)细胞比例增加(P<0.05),促进淋巴细胞中CD4^(+)/CD3^(+)T、CD69^(+)/CD8^(+)T细胞比例增加(P<0.05)及其特异性CD8+T细胞比例增加(P<0.05);利用C1498-mWT1小鼠急性髓系白血病皮下荷瘤模型的抗肿瘤效应中,WT1+AddaVax^(TM)组中位生存期相比于WT1组小鼠延长了6 d。在第50天时,WT1多肽+AddaVax^(TM)组小鼠生存率为28.5%,其他组小鼠全部死亡(P<0.05)。结论 WT1多肽联合AddaVax^(TM)乳佐剂疫苗具有良好的免疫学和明显抗肿瘤效果。

胃癌患者肿瘤组织中B细胞的浸润及其免疫抑制功能的研究

目的 检测B细胞在胃癌患者肿瘤组织和正常胃组织中的分布,分析其表型特征并探究肿瘤组织来源的B细胞对T细胞增殖的影响。方法 采用免疫组织化学染色对33例胃癌患者的肿瘤组织和正常胃组织切片进行B细胞表面标志CD19染色并分析其浸润数目,同时采用流式细胞术检测肿瘤组织和正常胃组织中B细胞的趋化因子受体和免疫球蛋白分子表达水平,并通过趋化实验研究CXCL12-CXCR4轴对B细胞的趋化作用,最后分离纯化出肿瘤组织和正常胃组织中的B细胞与自体的外周T细胞共培养,探讨B细胞对T细胞增殖的影响。结果 胃癌患者肿瘤组织中B细胞的浸润数目显著高于正常胃组织(P<0.01);且与正常胃组织来源的B细胞相比,肿瘤组织来源的B细胞高表达趋化因子受体CXCR4(P<0.05);TCGA数据库表明胃癌患者肿瘤组织中CXCL12的表达水平与CD19的表达水平呈正相关(r=0.15,P<0.01),胃癌患者临床样本的肿瘤组织中CXCL12的表达水平与B细胞浸润数目亦呈正相关(r=0.93,P<0.05),趋化实验证实CXCL12-CXCR4轴参与促进B细胞的趋化(P<0.05);尽管B细胞在肿瘤组织和正常胃组织中表达的IgM、IgG和IgA相当,但是体外共培养研究显示,与正常胃组织来源的B细胞相比,肿瘤组织来源的B细胞可显著抑制T细胞的增殖(P<0.01)。结论 B细胞在胃癌组织中的浸润增加,其可能通过CXCL12-CXCR4轴被募集至肿瘤组织,进而抑制T细胞的增殖以参与促进胃癌的进展。

金黄色葡萄球菌巨噬细胞胞内生存关键分泌蛋白筛选体系的构建

目的建立金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)巨噬细胞胞内感染状态下分泌蛋白高通量筛选体系,探索金葡菌胞内生存所需关键分泌蛋白。方法利用课题组建立的金葡菌分泌蛋白真核系统表达载体库,通过DNA转染表达技术,得到能够在细胞内表达金葡菌分泌蛋白的RAW264.7巨噬细胞阵列。金葡菌感染RAW264.7后,清除胞外菌,观察金葡菌胞内生存情况。最后通过构建相应分泌蛋白的过表达及敲除金葡菌验证筛选结果。结果通过探索RAW264.7质粒转染剂量、金葡菌感染复数(multiplicity of infection,MOI)以及感染时间,确立筛选体系的最优质粒转染剂量为1.0μg/孔、MOI为1.0、感染时间为4 h。筛选结果结合相应分泌蛋白过表达和敲除菌株验证,成功筛选出hypothetical protein、Serine protease E等分泌蛋白具有促进胞内金葡菌生存功能。结论成功构建金葡菌巨噬细胞胞内生存关键分泌蛋白筛选体系。

合成生物学助力细菌疫苗研发

细菌感染已成为全球第二大死亡因素,给人类健康与公共安全造成了巨大威胁。抗生素一直是治疗细菌感染最为主要的手段,但越来越严重的耐药问题给传统的抗生素疗法带来了严峻挑战。除了抗生素之外,疫苗被认为是防治传染性疾病传播最为科学、经济、安全和有效的手段,在人类抗击病原体感染斗争中发挥了重要作用。然而,细菌基因组庞大,致病机制复杂,研发疫苗存在有效抗原筛选、设计、制备难,抗原组合配伍难,有效性评价难,研发周期长等诸多瓶颈,导致细菌疫苗研发进展缓慢,尤其是临床常见的严重耐药致病菌尚无有效的疫苗可用。合成生物学是一门新兴的交叉学科,近年来在疫苗研究领域已经得到了广泛应用,包括抗原的筛选、理性设计、配伍组合,载体、佐剂和递送系统的设计以及免疫应答调控等。本文综述了细菌疫苗研究的现状以及耐药细菌疫苗临床试验研究进展,总结了合成生物学技术在几种重要类型细菌疫苗研发中的应用进展,最后对相关前景进行了展望。合成生物学在疫苗的形式、疫苗递送、疫苗的研制效率等方面为研究人员提供了更为广阔的空间,未来,应最大化地发挥合成生物学的优势,充分发展和应用合成生物学技术手段,建立科学、理性、有效、可行的管理制度,建设生物安全保障法律体系和监管措施,高效推动细菌疫苗研发,解决抗生素耐药问题,造福人类健康。

藤黄属药用植物活性成分的药理作用及其机制研究新进展

近年来,由于藤黄属活性成分具有显著的抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等众多药理作用的独特优点而受到研究者广泛关注。藤黄属植物(Garcinia Linn.)所分泌的干燥胶树脂,其化学成分主要有桥环类环氧杂蒽酮、糖、黄酮、三萜等,其活性成分包括藤黄酸、新藤黄酸、α、β-藤黄素,藤黄宁和别藤黄酸等。本文对其抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等药理活性及其作用机制进行较为系统综述,期望为更好地利用与开发藤黄属药用植物奠定坚实基础。

基于多肽-泊洛沙胺纳米颗粒载体的呼吸道黏膜 mRNA疫苗研究

目的设计并制备mRNA-多肽-泊洛沙胺纳米颗粒(mRNA peptidepolymerternary complex,mRNA-PPTC),考察其理化特性、体外和体内呼吸道组织相关细胞递送效率、免疫后小鼠特异性抗体诱导能力。方法通过体外转录分别制备编码萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase,F-luc)、增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)和新冠病毒受体结合域蛋白(receptorbinding domain,RBD)的mRNA,利用动态光散射法检测mRNA-PPTC的粒径、多分散系数、Zeta电位。通过透射电镜观察纳米颗粒形态。将F-lucmRNA-PPTC及对照组制剂分别转染至人支气管上皮细胞(16 human bronchial epithelial cell,16HBE)、鼠源树突状细胞(dendritic cell2.4,DC2.4)、鼠源巨噬细胞(mouse leukemia cells of monocyte macrophage,RAW264.7),检测荧光素酶报告基因转染效率和细胞活性;将EGFPmRNA-PPTC及对照组制剂转染至16HBE细胞,使用荧光显微镜观察EGFP表达情况。利用活体成像技术考察F-lucmRNA-PPTC在小鼠呼吸道的转染效率。选用编码RBD蛋白的mRNA作为疫苗抗原模型,通过酶联免疫吸附实验检测免疫后小鼠血清中抗原特异性免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)和支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中抗原特异性分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,sIgA)水平。结果成功制备粒径约100nm近球形且均一稳定的弱阳离子mRNA-PPTC纳米颗粒;mRNA-PPTC能有效转染16HBE、DC2.4、RAW264.7细胞,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),并且细胞毒性较低;mRNA-PPTC通过滴鼻免疫后,在小鼠鼻部和肺组织中检测到F-luc报告基因的有效表达,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);在初免后第28天的小鼠血清和BALF样品中,能分别检测到高效价的RBD抗原特异性IgG和sIgA,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。结论mRNA-PPTC纳米颗粒有良好的体外mRNA递送能力且细胞毒性较低;滴鼻给药后在小鼠上下呼吸道均能高效表达目的基因;小鼠滴鼻免疫后能产生高水平的抗原特异性血清IgG和支气管肺泡灌洗液sIgA。

印苦楝内酯靶向RNF114治疗金黄色葡萄球菌急性肺炎

目的探究印苦楝内酯(nimbolide,NIM)治疗金黄色葡萄球菌急性肺炎作用机制。方法通过气管插管构建小鼠金葡菌急性肺炎模型,NIM治疗后,观察小鼠生存率差异,平板培养分析肺部荷菌量变化,ELISA检测肺组织炎性细胞因子表达差异;ELISA及Western Blot检测腹腔原代巨噬细胞感染金葡菌后,NIM对炎症细胞因子的表达水平及炎症通路激活的影响;慢病毒shRNA敲低原代腹腔巨噬细胞RNF114蛋白水平,通过ELISA及Western Blot探究NIM是否通过RNF114抑制炎症反应。结果金葡菌感染小鼠肺部后可导致急性死亡,NIM显著提高了小鼠生存率,下调小鼠肺部炎症细胞因子水平,但短期内不影响金葡菌肺部定植;巨噬细胞感染结果表明,NIM可能通过调控RNF114功能,下调ERK的磷酸化水平抑制MAPK通路激活,进而抑制炎症细胞因子的表达。结论NIM可能通过调控巨噬细胞RNF114功能,抑制MAPK通路激活进而抑制小鼠肺部炎症细胞因子的表达,最终抑制金葡菌急性肺部高炎症导致的小鼠死亡。

铜绿假单胞菌重组PcrV-OprI疫苗保护小鼠骨折固定术后感染的作用

目的构建髓内针固定小鼠开放性股骨骨折后铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)感染模型,评价候选PA疫苗重组PcrV-OprI的免疫保护效果。方法采用大肠杆菌表达PcrV-OprI蛋白,依次经亲和、疏水层析纯化得到目的蛋白。C57BL/6J小鼠在第0、14、21天免疫PcrV-OprI蛋白后,使用酶联免疫吸附法检测血清中特异性IgG抗体及亚型效价。末次免疫后14 d,进行髓内针固定小鼠开放性股骨骨折术。术后PAO1菌株感染,通过比较免疫组与对照组细菌定植、体质量、组织病理学和X线影像表现等差异,评价PcrV-OprI抗原保护效果。结果PcrV-OprI免疫组小鼠血清中特异性抗体水平显著升高(P<0.05),且以IgG1亚型为主;PcrV-OprI免疫组体质量减轻幅度显著低于对照组(P<0.05),PcrV-OprI免疫组软组织、骨内、植入物细菌数量显著低于对照组(P<0.05);PcrV-OprI免疫组炎症病理损伤小于对照组;在观察期结束时,PcrV-OprI免疫组骨折线清晰且逐渐闭合,呈愈合趋势而对照组骨折处未见明显愈合。结论PcrV-OprI免疫能有效引起小鼠体液免疫应答,在开放性骨折髓内针固定术后PA感染模型中具有显著保护效果。

中华鳖甲超微细粉中氨基酸及钙、镁元素分析

本文采用氨基酸自动分析仪测定鳖甲超微细粉中的氨基酸种类和含量,同时运用了EDTA络合滴定法测定了鳖甲超微细粉中的镁含量,以及探讨了水相中直接测定钙的改进方案。

新型冠状病毒肺炎治疗药物的研究现状及对策建议

自新型冠状病毒(SARS-CoV-2)疫情发生以来,国内外多家研究机构投入到抗新型冠状病毒肺炎(简称新冠肺炎,coronavirus disease 2019,COVID-19)的药物研发中。目前主要采取老药新用的策略,筛选抗新冠病毒和抑制过度免疫反应的候选药物,相关研究已经取得了重要进展。本文在综述已经纳入国家卫健委印发的新型冠状病毒肺炎诊疗方案中以及在体外已经证实对新型冠状病毒具有抑制作用的药物研发和临床应用的现状的基础上,对未来新冠肺炎治疗药物的研究对策提出建议:①从"老药新用"策略向创新药物研发转变;②构建可靠的体内外药物筛选模型;③建立新冠肺炎药物研发的协同创新机制;④有序开展新冠肺炎的药物临床试验;⑤建立冠状病毒研发的长效机制。

氨基酸钙复合物增加大鼠骨密度的研究

目的 研究氨基酸钙复合物对SD大鼠骨密度的影响。方法 将SD大鼠随机分成 6组 ,分别喂养氨基酸钙复合物、碳酸钙和低钙饲料 ,通过测量相应饲料喂养大鼠的身长和体重 ,钙表观吸收率 ,以及股骨的长度、重量、骨密度、钙含量等指标 ,观察氨基酸钙复合物对SD大鼠骨密度的影响。结果 3种剂量水平氨基酸钙复合物实验组及 2种剂量水平碳酸钙对照组大鼠的股骨长度、股骨干重、股骨骨密度、股骨骨钙含量以及身长显著高于低钙饲料对照组 (P <0 .0 1)。 2种剂量水平氨基酸钙复合物实验组大鼠的股骨骨密度及股骨骨钙含量显著高于相同钙含量的 2种剂量水平碳酸钙对照组 (P <0 .0 1)。氨基酸钙复合物的钙表观吸收率两组差异非常显著 (P <0 .0 1)。

超级细菌疫苗研究进展

＂超级细菌＂（superbugs）是指对抗生素有超强耐药性细菌的统称。随着抗生素滥用问题日益严重,耐药细菌不断出现并呈全球化流行趋势,＂超级细菌＂的家族也越来越庞大,已成为引起临床感染的严重病原菌,可能面临无药可治的境地。2014年世界卫生组织发布的《抗菌素耐药：全球监测报告》显示：每年美国因感染超级耐药细菌而死亡的人数高达6.3万人,

超级细菌疫苗研究的挑战与策略

超级细菌(superbugs)泛指那些对多种抗生素具有耐药性的细菌,专业术语是'多重耐药性细菌'。2017年,WHO列出严重威胁人类的12种耐药细菌清单,金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌在清单中分别位列G^+菌首位和G^-菌前3位。因现在大部分的抗生素对它们已失去效力,全人类将面临难以承受的巨大挑战与威胁。疫苗是防控致病菌流行感染最佳的科学手段。我国科学家团队已研制国际首个靶标最多、效果最佳的金黄色葡萄球菌疫苗,正开展Ⅱ期临床试验。近20年来,欧美国家先后研发20余种超级细菌疫苗进行临床试验,但尚无一项成功。超级细菌疫苗研究面临巨大的挑战,如超级细菌致病机制不详,超级细菌疫苗如何在易感人群快速起效,超级细菌动物模型、临床流行病学基础数据和临床试验评价的关键技术及标准缺乏等均是目前超级细菌研究亟待解决的难题。我们建议今后的研究围绕以下几个方面进行:①建立保护性抗原表位大数据及高通量筛选新技术;②研究耐药菌疫苗快速起效机制及新技术;③开展超级细菌疫苗使用人群的免疫应答规律及特征研究;④建立成熟、稳定的超级细菌感染动物模型;⑤运用大数据、人工智能、基因组学等建立超级细菌流行病学大数据库和菌种资源库;⑥开展细菌疫苗的免疫保护机制及其核心指标的研究。

人白细胞介素2受体α链cDNA导入哺乳细胞及其克隆与稳定表达的研究

按DNA—磷酸钙共沉淀法将人白细胞介素2受体α链cDNA转染中国仓鼠卵巢细胞(CHOdhfr^-)及小鼠成纤维细胞(L929),获得稳定表达人IL-2Rα链的CHOdhfr^+细胞克隆。经RNA点渍杂交分析、荧光标记IL-2染色法、特异性ELISA和玫瑰花环试验检测证明,哺乳细胞表达的重组IL-2Rα链具有结合IL-2和抗Tac McAb的能力。还报道了T细胞白血病Jukat及Molt-4等细胞系异常表达IL-2R的结果,并作了分析讨论。

抗HIV病毒药物结构设计的进展

抗ＨＩＶ病毒药物结构设计的进展邹全明１李华２鲁东水１李文健１综述朱锡华２审阅治疗人类免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）感染药物的研究进展较快，自病毒发现以来的１２年内，四种抗病毒药物已经注册，其中三种是在过去两年内完成注册的。然而，尽管做了这些大量的努力，对于获...

重组CHO细胞高效表达人IL-2Rα链的研究

将人IL-2Ra cDNA导入CHOdhfr^-细胞,经ELISA对180个重组克隆的鉴定,筛选出13株高产克隆,其OD值均大于0.80。再经MTX扩增基因试验,获得了3株更高表达水平的克隆,其OD值分别为1.95、1.86及1.66。稳定性试验表明:MTX诱导前的高效表达水平在30代次时未见改变,MTX的扩增基因效果可维持15—20代次,rIL-2Ra的分子量为50—55kd,具有Tac抗原性和结合IL-2的能力。Southern分析证实:MTX是通过扩增外源基因的份额来提高重组产物的表达水平。本试验为发酵培养重组CHO细胞、大量制备IL-2Ra蛋白奠定了坚实基础。

幽门螺杆菌疫苗的研究进展

幽门螺杆菌(H.pylori)是人类上消化道疾病的重要致病菌,为慢性胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡的主要病因。目前临床治疗尚存在诸多不足,研制疫苗对预防和控制H.pylori感染具有十分重要的意义。经过20余年的发展,H.pylori疫苗在动物模型建立、候选抗原的选择、佐剂和投递方式的优化等方面均已取得了较大突破。本文主要就全菌疫苗、亚单位疫苗(基因工程疫苗)、活载体疫苗和DNA疫苗四种类型的H.pylori疫苗的研究现状作一概述。

肠出血性大肠杆菌O157感染防治研究进展

肠出血性大肠杆菌 (EHEC)感染是一种重要的新发传染病 ,O15 7是EHEC的一个主要菌型 ,感染该菌可使人患腹泻、出血性结肠炎 (HC)、溶血性尿毒综合征 (HUS)等 ,死亡率较高。EHECO15 7感染在许多国家包括我国都有暴发流行。EHECO15 7产生的粘附因子Intimin可引起粘附擦拭 (A/E)损伤 ,并可产生致死性的毒素Stx。抗生素治疗可使患者并发HUS危险性增加 ,临床上无特效的治疗药物 ,疫苗研究将对EHECO15 7的控制起重要作用。

幽门螺杆菌感染的免疫防治

幽门螺杆菌感染与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌及胃黏膜相关性淋巴瘤有关。疫苗是防治幽门螺杆菌感染切实可行的方法。近年来新的防治和根除幽门螺杆菌感染的疫苗正在开发并取得了很大的进展。本综述结合本室研制Hp疫苗的研究基础,简要概述疫苗保护性抗原的筛选、黏膜免疫佐剂及接种途径、Hp疫苗的保护性免疫机制、Hp感染动物模型的建立及Hp疫苗人体临床试验等方面的研究进展。