水稻黄单胞菌黄色素合成相关基因的克隆与鉴定

用硫酸二乙酯 (DES)诱变水稻白叶枯病菌 (Xanthomonasoryzaepv .oryzae,简称Xoo)和条斑病细菌 (Xanthomonasoryzaepv.oryzicola ,简称Xooc) ,分别得到 5株和 1 3株黄色素缺失突变体 ,其中来自Xooc的M6和M1 2还丧失了对水稻的致病性和在烟草上激发过敏反应的能力。以Xooc黄色素缺失突变体M5 1为受体菌交叉互补从XooJXOIII基因文库中筛选出一个黄色素合成相关的基因克隆pA341 ,以Xoo黄色素缺失突变体M1 0 71为受体菌 ,从XoocRS1 0 5基因文库中获得了一个黄色素合成相关的基因克隆pA2 70。功能互补显示 ,1 8株黄色素缺失突变体中的 1 0株能分别被pA341和pA2 70互补后正常产生黄色素 ,但这两个克隆不能同时互补同一株黄色素缺失突变体。能被pA341互补的黄色素缺失突变体M6没有恢复对水稻的致病性和在烟草上激发过敏反应 ,表明黄色素合成相关基因与hrp基因间不存在相关性。斑点杂交结果表明 ,pA2 70与pA341之间没有同源性。pA2 70亚克隆结果显示 ,与黄色素合成相关的基因约 1 1 6kb大小 ,以基因簇的形式存在 ,不仅决定了黄色素的产生 ,还影响黄色素合成的数量和质量 (吸收峰 )。在紫外光条件下 ,黄色素能够提高菌体的存活率 。

柑橘溃疡病抗感病性机制研究进展

柑橘溃疡病是世界范围内危害柑橘产业的重要细菌性病害,被列为国内外检疫对象。近年来,在研究柑橘溃疡病的抗性遗传和分子机制方面取得了快速进展,叶片的气孔密度和气孔结构是柑橘先天防卫系统,成为品种抗性的一个生理指标;在病原菌的诱导下,柑橘植物合成的过氧化物酶、植保素和沈香醇等代谢产物影响柑橘的抗感病性,激素物质促进了溃疡病斑的形成;转录组学研究揭示了柑橘抗感品种基因表达的差异,特别是发现了柑橘植物中与病原菌效应蛋白PthA4对应的感病基因CsLOB1,为柑橘抗病育种提供了新的发展策略。本文主要综述柑橘先天防卫系统、代谢产物、植物激素和感病基因在柑橘抗感病性产生中作用,柑橘抗感品种在基因表达上的差异。

红花羊蹄甲种子活性物质提取及其抑菌作用研究

为了验证红花羊蹄甲种子提取物是否有抑菌活性,通过超声波破碎提取红花羊蹄甲种子的活性物质,再由超滤离心管分离其中的蛋白。平板抑菌圈试验结果表明,该活性物质对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、番茄青枯菌、柑橘溃疡病菌和烟草野火细菌6种病原菌均有抑制作用。SDS-PAGE电泳结果表明,抑菌物质不是蛋白质组分。

植物病原细菌Harpin类蛋白简介

Harpin类蛋白是广泛存在于革兰氏阴性植物病原细菌中的一类蛋白质,它们具有相似的生化特性:富含甘氨酸(Gly)、缺少半胱氨酸(Cy)s、热稳定、对蛋白酶敏感等。它们的编码基因大多位于hrp基因簇,其决定寄主植物上的致病性和非寄主植物上的过敏性反应(HR,hypersensitive response)。本文简述了目前已知的Harpin蛋白、其在植物细胞上的作用位点以及涉及的信号途径。Harpin类蛋白不仅能够诱导植物的抗病、抗虫性,还具有促进植物生长和抗逆性的功能,因此其作为生物农药具有广泛的应用前景。

苜蓿中华根瘤菌nifA基因突变影响多种细胞学过程(英文)

苜蓿中华根瘤菌nifA基因在共生固氮过程中担负着调控功能,nifA突变株Rm1354在宿主植物的根部诱导白色无效根瘤。本文报道Rm1354在自生状态下的表型变化。nifA的突变导致根瘤菌在半固体培养基上泳动变慢,胞外蛋白含量降低。有趣的是,Rm1354在延宕期间高丝氨酸内酯含量比野生型低,在指数期和静止期却比野生型高。另外,突变株Rm1354的竞争结瘤能力也大大减弱。这些结果揭示了苜蓿中华根瘤菌nifA基因对许多细胞学过程都有调控作用。

白叶枯病菌和细菌性条斑病菌多样性的TALE效应蛋白调控水稻抗(感)病性机理与利用策略

培育和种植抗病品种是防治水稻白叶枯病和条斑病的有效措施。最近几年有关TALE效应蛋白调控水稻抗(感)病性研究取得了突破性进展,这将改变水稻抗性品种培育策略。为此,本文对稻黄单胞菌-水稻互作系统中已知TALE效应蛋白与水稻中的已知或未知抗(感)病基因(R或S)的对应关系进行了归纳,并就tale基因进化及对应水稻R或S基因发掘进行了分析。另外,文中还对以TALE为基础发展而来的TALEN技术遗传修饰水稻感病基因的前景进行了展望。利用TALEN技术可将高产优质但感病的水稻品种(材料)转变为高产优质兼广谱抗病的水稻品种(材料)。

hrcQ基因决定水稻条斑病菌在非寄主烟草上的过敏性反应和在寄主水稻上的致病性

水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola)hrcQ基因在动植物病原细菌中高度保守。不同植物病原细菌的HrcQ蛋白因在N端有变化,推测可能与分泌的效应分子特异性有关。但水稻条斑病菌HrcQ蛋白对Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system,T3SS)的形成以及对效应分子的分泌性影响还不清楚。为弄清HrcQ蛋白在此方面的作用,利用同源重组方式获得了水稻条斑病菌hrcQ基因的敲除突变体,该突变体丧失了在烟草上激发过敏性反应的能力和在水稻上的致病性。hrcQ基因与水稻细胞互作时受诱导表达。蛋白质-蛋白质互作结果显示,HrcQ可分别与Hpa1、HrcN、HrpB5和HrpB2互作。分泌性检测发现,HrcQ不通过T3SS分泌至胞外。hrcQ基因突变,影响Hpa1和HrpB2蛋白分泌。这些结果表明,HrcQ蛋白是形成Ⅲ型分泌系统的基本组分,并通过帮助Hpa1和HrpB2等T3SS效应因子的分泌,从而影响病菌在非寄主上的过敏性反应和在水稻上的致病性。这为进一步分析水稻黄单胞菌T3SS的形成和分泌机制奠定了基础。

水稻条斑病菌xopQ1_(Xoc)在病程中功能的初步研究

【目的】基因组学揭示,水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,Xoc)中存在与丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv. tomato,Pst)中通过Ⅲ型分泌系统分泌的HopQ1-1同源的XopQ1Xoc,但其是否为T3S效应分子以及在病菌致病性中的功能并不清楚。【方法】通过基因敲除技术,获得了水稻条斑病菌xopQ1Xoc的突变体。【结果】致病性测定结果发现,xopQ1Xoc突变后,病菌在水稻上的毒性增强,细菌生长能力增强。非常有意义的是,xopQ1Xoc突变体菌液浓度为3×108CFU/mL时仍能在烟草上激发过敏反应,但在浓度为104CFU/mL时,8d后可在烟草上产生坏死症状。功能互补结果显示,xopQ1Xoc能够恢复突变体在水稻上的毒性至野生型水平和在烟草上丧失产生坏死病斑的能力。Western杂交结果显示,XopQ1Xoc不能通过T3S装置进行分泌。【结论】XopQ1Xoc是水稻条斑病菌T3S效应分子,可能作用于植物的免疫系统,有利于病害的发展。为进一步揭示水稻-黄单胞菌互作的分子机理提供了科学线索。

水稻条斑病菌avrBs3/pthA家族基因敲除体系的建立

水稻细菌性条斑病菌存在至少20个avrBs3/pthA家族成员,但其在水稻上的毒性或无毒性贡献并不清楚.本文依据avrBs3/pthA结构上的保守性,利用同源重组策略,借助自杀性载体pKMS1介导,对水稻条斑病菌中的avrBs3/pthA家族基因进行敲除.结果发现:同源交换可通过基因内和基因间重组实现avrBs3/pthA家族的基因敲除;PCR和Southern杂交结果显示,水稻条斑病菌中有5个avrBs3/pthA家族基因被成功敲除,表明水稻条斑病菌avrBs3/pthA家族基因敲除体系构建成功.这为逐一评价avrBs3/pthA家族基因的毒性或/和无毒性功能奠定了基础.

用于植物病原细菌标记的pBB-GFP载体构建及应用

扩增青枯劳尔氏菌RipAK基因启动子序列,与lacZ基因融合得到p HM1:P_(RiPAK)LacZ。携带pHM1:P_(RiPAK)LacZ的青枯劳尔氏菌在营养丰富和基本培养基中都有LacZ活性,表明RipAK启动子可以推动lacZ基因的表达。为构建用于标记植物病原细菌的绿色荧光表达载体,把RipAK启动子和gfp基因克隆到质粒pBBR1MCS-5,使得gfp基因在RipAK启动子的驱动下表达;构建的表达载体pBB-GFP在大肠杆菌中即可表达绿色荧光蛋白。pBB-GFP载体能有效标记青枯劳尔氏菌、番茄细菌性斑点病菌和柑橘溃疡病菌,在荧光显微镜下观察到3种植物病原细菌呈短杆状,青枯劳尔氏菌还可形成多个菌体串联的线状结构。荧光标记对3种病原菌在寄主植物上的致病力没有影响,将标记菌株分别滴加在寄主植物叶片的创伤处,可观察到大量的绿色荧光聚集。本研究构建的pBB-GFP载体能用于多种植物病原细菌的绿色荧光标记,标记后的病原细菌在液体培养及侵染寄主植物过程中都能观察到荧光。

水稻白叶枯病菌hrcU基因缺失突变体构建及功能研究

通过基因敲除方式,构建了水稻白叶枯病菌hrcU基因的缺失突变体。突变体丧失了在水稻上的致病性和在非寄主植物上的过敏反应。携带hrcU基因的黏粒完全互补了hrcU突变菌株的表型,互补菌在水稻组织中的生长能力也与野生型菌株相当。免疫杂交结果显示,hrcU基因突变后,水稻白叶枯病菌的Harpin蛋白Hpa1不能从细胞内分泌到胞外。这些结果表明,水稻白叶枯病菌hrcU基因的主要功能是形成Ⅲ型分泌系统,将效应分子分泌到病原细菌胞外,从而决定了在非寄主上的过敏反应和在水稻上的致病性。

利用编码harpin蛋白的基因遗传改良生防荧光假单胞菌2P24

荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens 2P24是根围促生细菌(PGPR),具有Ⅲ型分泌系统(T3SS)。为了在2P24中表达植物过敏反应激发子harpin,赋予生防菌诱导抗病性能力,本文选择可在2P24中表达的来自Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000的avrPto1基因启动子与水稻细菌性条斑病菌Xanthomonasoryzae pv.oryzicola harpin蛋白编码基因hpa1进行融合,实现了harpin蛋白在2P24的表达。重组菌株通过T3SS分泌harpin蛋白,可激发烟草产生过敏反应(HR),激活HR途径的HIN1基因和HRS203J基因以及病程相关蛋白PR1a基因的转录表达。harpin重组菌株与2P24一样,对小麦赤霉病菌Fusarium graminearum和棉花枯萎病菌F.oxysporum f.sp.vasinfectum具有抑制作用。这为利用植物-病原物互作中激发植物产生抗病性的激发子来遗传改良生防微生物奠定了理论和实践基础。

柑橘次级代谢产物β-蒎烯对柑橘溃疡病菌的生长抑制作用与机理初探

通过体内外生长曲线和表型观察试验,分析不同浓度β-蒎烯对柑橘溃疡病菌(Xcc 29-1)的生长抑制作用和柑橘溃疡病症状形成的影响。利用β-葡萄糖苷酸酶基因的定性检测和实时荧光定量PCR分析不同浓度β-蒎烯对Xcc 29-1Ⅲ型分泌系统相关基因hrp G的诱导作用。结果表明:随着浓度的升高,β-蒎烯对Xcc 29-1的生长抑制增强,0.2μg·mL^(-1)的β-蒎烯能显著抑制溃疡病菌的生长繁殖,培养基中添加1μg·mL^(-1)β-蒎烯时,Xcc 29-1几乎不能生长。同时,0.1μg·mL^(-1)的β-蒎烯能有效在体内外诱导Ⅲ型分泌系统相关基因hrp G、hrp X、hrc V和hrp D6的转录表达。β-蒎烯作为柑橘的次级代谢产物可抑制Xcc 29-1的生长繁殖,抑菌作用的大小与其浓度正相关。与此同时,β-蒎烯能诱导Ⅲ型分泌系统相关基因的表达。说明β-蒎烯抑制的不是菌物的致病力,而是菌物的繁殖。

柑橘溃疡病菌胞外蛋白水解酶对其致病力的作用

采用异源表达方法从柑橘黄单胞柑橘亚种(Xcc)中国菌株Xcc 29-1中鉴定出6个编码胞外蛋白水解酶的基因.运用同源重组方法将6个编码基因全部敲除,得到胞外蛋白水解酶缺失突变体,对其致病力、形成生物膜的能力和生长繁殖速度进行检测.结果显示,蛋白水解酶突变体在柑橘上的致病力减弱,并且附着到试管壁的细菌数量显著减少,形成生物膜的能力下降.在野生型菌株中过表达蛋白水解酶后,形成的溃疡病斑水渍状程度加大,在柑橘中的繁殖速度变快;在柑橘叶片中,6个胞外蛋白水解酶基因的转录水平都增强表达.这些结果表明Xcc的胞外蛋白水解酶是一个重要的致病因子.

青枯菌效应蛋白RipAF1对植物PTI的诱导作用

青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)利用Ⅲ型分泌系统(Type three secretion system, T3SS)将自身合成的100多个效应蛋白注入寄主植物细胞引起免疫反应的变化。本文报道青枯菌GMI1000效应蛋白RipAF1对寄主植物先天免疫反应的诱导作用。在本氏烟草植物上瞬时表达RipAF1,显著地诱导了PTI标志基因NbAcre31、NbPti5和NbGras2的增强表达,伴随着胼胝质的累积。酵母双杂交实验从烟草cDNA文库中筛选到与RipAF1互作的NbBAK1的C端序列,随后的荧光素酶和双分子荧光互补实验表明RipAF1与BAK1在植物体内相互作用。在GMI1000菌株中将ripAF1缺失突变,在营养丰富和基本培养基中生长与野生型没有明显区别,灌根接种番茄后致病力增强,在番茄植物体内的繁殖速度变快。这些结果表明RipAF1是一个诱导寄主植物PTI反应的效应蛋白,并且负向影响青枯菌的致病力。

水稻条斑病菌胞外多糖相关基因的鉴定

【目的】前期研究中从Tn5转座子插入的水稻条斑病菌突变体库中获得了17个胞外多糖改变的突变体。【方法】本文对这些突变体的Tn5插入位点和基因类型进行了鉴定。【结果】结果显示,胞外多糖减少的11个突变体中多数为Tn5插入在已知的gum、xan和wxoc基因簇上,Xoryp_4217、Xoryp_2488和Xoryp_0918为未知的与胞外多糖产生有关的基因,属首次报道;6个胞外多糖增多的突变体中,fimO、pilY和xopQ与胞外多糖产生有关,但在水稻条斑病菌中未见报道;Xoryp2392、Xoryp_4221和Xoryp_3511为首次鉴定,其中Xoryp_3511仅在水稻黄单胞菌中存在。毒性测定结果显示,胞外多糖减少的突变体在水稻上的毒性变弱,而胞外多糖增加的突变体在水稻上的毒性没有显著变化。【结论】这些结果为进一步分析水稻条斑病菌胞外多糖代谢途径以及与水稻的互作关系奠定了基础。

水稻黄单胞菌致病相关基因插入突变体系的建立

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)和条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)是水稻上的模式病原菌,分别引起水稻白叶枯病(bacterial blight,BB)和细菌性条斑病(bacterial leaf streak,BLS)。为了精确和高效地实现目的基因的突变,本研究利用pK18mobGⅡ载体,建立了一套适于Xoo和Xoc目的基因定点插入的突变体系。通过同源片段与目的基因间的同源重组,成功获得了Xoo和Xoc的hrcV和hrpF突变体。PCR和Southern杂交证实:pK18mobGⅡ携带不同大小的同源片段,能够整合于hrcV和hrpF的特定位点;200～400 bp的同源片段能够获得最佳的突变效率;两亲接合的转化效率是电转化的5～100倍。毒性测定结果显示,hrcV基因决定着Xoo在水稻上的致病性。致病相关基因插入突变体系的建立为研究水稻黄单胞菌与水稻互作中致病相关基因的功能奠定了遗传学研究基础。

柑橘溃疡病菌Ⅱ型分泌通道基因xpsD突变体的鉴定及功能分析

【目的】鉴定柑橘溃疡病菌胞外水解酶减弱突变体Mxac56-20的Tn5插入位点,及其在柑橘上的致病力。【方法】采用质粒拯救方法获得Tn5旁侧序列,与基因组信息比对后明确突变体的插入位点;构建功能互补载体对突变体进行功能互补,检测互补菌株胞外蛋白水解酶、纤维素酶和淀粉酶的恢复情况;在寄主植物柑橘上观察致病力变化。【结果】Mxac56-20的Tn5插入位点是II型分泌系统xpsD基因,所构建的互补载体使突变体的胞外水解酶活性和致病力得到恢复。【结论】柑橘溃疡病菌xpsD基因的突变,导致胞外水解酶活性降低,在寄主上的致病力减弱,说明柑橘溃疡病菌的II型分泌系统在与寄主互作过程中起到致病因子的作用。

nifA突变的苜蓿根瘤菌在根瘤中的转录组学分析

用全基因组微阵列比较了根瘤中苜蓿根瘤菌1021的nifA突变菌和野生菌的基因表达谱.分析结果表明,nifA的缺失引起601个基因的表达发生变化.这些基因分别属于生物大分子的合成代谢、三羧酸循环及呼吸代谢以及结瘤固氮过程等多个功能组,预示着根瘤中细菌的生长状态发生了显著的变化.在根瘤中,fixK以及受其激活的基因在nifA突变菌中的表达量显著高于野生菌.定量实时PCR分析表明,根瘤中fixLJ的转录水平在nifA突变菌中显著高于野生菌.通过统计学方法从13个表达发生显著变化的基因的上游调控序列中找到推测的NifA结合位点.

苜蓿中华根瘤菌烯脂酰ACP还原酶基因fabI1的功能研究

我们先前的工作表明,苜蓿中华根瘤菌的烯脂酰ACP还原酶基因fabI1在nifA突变根瘤中表达水平降低.本研究构建了fabI1的定点插入突变体.与野生型相比,突变菌株的生长速度变慢,在高浓度NaCl培养基上的生长能力降低.在半固体培养基上,该突变体的涌动能力完全丧失.在共生过程中,突变菌株在宿主植物上延迟结瘤,形成根瘤的能力下降.虽然苜蓿中华根瘤菌中的烯脂酰ACP还原酶基因fabI2的序列与fabI1有66%的一致性,但fabI2不能恢复fabI1突变体的表型,揭示了这两个基因在功能上的差异.