基于人诱导多能干细胞的组织工程化软骨再生

目的:构建一种稳定高效的人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)向软骨中胚层方向分化的培养方法,初步探究hiPSCs来源的软骨用于关节软骨再生的可能。方法:通过模拟体内发育过程和三维(three dimensions,3D)悬浮培养体系,逐步诱导hiPSCs向软骨中胚层和成熟的软骨组织分化;利用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)、蛋白质印迹法(Western blotting)、免疫荧光及免疫组织化学技术检测整个培养过程中多能干性、中胚层及软骨相关基因和蛋白的动态变化;最后利用裸鼠皮下模型研究hiPSCs软骨球软骨表型的稳定性及成瘤性。结果:通过模拟体内发育过程,成功逐步诱导hiPSCs向软骨中胚层方向分化,最终分化为成熟的软骨组织。结论:本研究成功构建了一种稳定高效诱导hiPSCs向软骨中胚层方向分化的培养体系,为探究hiPSCs介导的软骨组织发育和再生提供了一个研究平台。

高模量高强度丝素蛋白GBR膜的制备及性能评估

目的拟制备一种高模量和高强度的可降解丝素蛋白引导骨再生(GBR)膜,以解决骨缺损修复成骨空间维持问题。方法提纯丝素蛋白后利用蒸发-热压法制备膜材,使用拉伸测试、体外模拟、细胞共培养等方法评估其理化性质与生物性能。结果制得丝素蛋白GBR膜,体外模拟12 h降解率为35.3%,湿态弹性模量达45 MPa,拉伸强度达8.39 MPa,7 d细胞生存率近100%。结论所制得可降解GBR膜具有高模量和高强度,以及优异的生物相容性,有望为解决骨缺损修复成骨空间维持问题提供材料基础。

负载单宁酸的双层壳聚糖屏障膜的制备及其生物相容性的研究

目的制备负载单宁酸的双层壳聚糖膜(CS@TA),测试其活性氧(ROS)清除能力、生物相容性及抗菌性能,研究其作为引导骨再生屏障膜的可行性。方法采用自蒸发技术先制备出致密的单层壳聚糖(CS)膜,随后采用蒸发干燥、取向冷冻和冷冻干燥技术在单层CS膜上制备出多孔的CS层,从而得到双层CS膜,利用扫描电镜观察其微观结构。将制备好的CS双层膜先接枝4-羧基苯硼酸形成中间体,按不同比例接枝单宁酸(TA),使用傅里叶红外光谱仪(FITR)分析TA与CS双层膜的相互作用。通过1,1-二苯基-2苦基肼(DPPH)测试ROS清除能力,选取负载TA后ROS清除效率在90%以上的双层膜进行后续体外细胞实验,利用CCK-8及活死细胞染色测试其生物相容性,利用扫描电镜观察MC3T3-E1细胞在双层膜多孔面上的黏附情况,通过菌落计数测试其对金黄色葡萄球菌(E.coli)和大肠埃希菌(S.aureus)的抗菌性能。结果CS@TA双层膜一面光滑致密,另一面粗糙疏松多孔,截面呈垂直薄膜方向的有序多孔结构,随着TA的加入,双层膜的ROS清除能力先迅速增加后缓慢稳定,CCK-8及活死细胞染色结果显示加入过多的TA会明显影响双层膜的生物相容性,细菌稀释涂板计数结果显示加入适量TA的双层膜与未负载TA的双层膜相比,对E.coli和S.aureus具有一定抗菌能力。结论负载适量TA的双层膜具有较强的ROS清除能力,良好的生物学性能,且对E.coli和S.aureus均具有一定的抗菌能力。

一种基于残差网络改进的牙齿颜色分类模型

针对传统牙齿比色方法准确率低和效率低等问题,提出一种基于残差网络改进的牙齿颜色分类模型。该模型通过融合多层卷积结果以及引入压缩与激励注意力机制模块的方式,使网络能学习到更多的图像颜色特征。基于典型牙齿所建数据集进行颜色分类实验,在该数据集上对文中模型与GoogleNet、MobileNet-V1、ResNet-34和ResNet-50等模型进行颜色分类预测结果比较。实验结果表明,文中模型优于传统模型,预测分类准确度达到91.16%,有效提高了牙齿颜色分类准确率和效率。

“以稳定为核心”的牙槽骨修复重建治疗新技术

经过40余年临床应用与不断发展,引导骨组织再生术(guided bone regeneration,GBR)已被证明是一种可靠的牙槽骨骨增量技术。GBR技术在应用过程中的核心要素是充足的血供和稳定的环境。但现有GBR技术都是在“以血供为核心”的理论体系下进行的,缺乏对稳定要素重要性的重视。我们通过文献阅读及系列临床试验,提出“以稳定为核心”的牙槽骨修复重建理念。基于新理念,创建了以单纯人工骨粉修复牙槽骨重度缺损的治疗新术式,革新了国际上必须用自体骨修复骨缺损的治疗理念。本文将从GBR技术的历史发展轨迹中寻找稳定的重要性,结合现有骨再生理论,详细阐述“以稳定为核心”的牙槽骨修复重建治疗新技术。

一种诱导牙髓干细胞神经向分化的有效方法和诱导时间的探索

目的 建立一种简单而高效的诱导牙髓干细胞(DPSC)向神经向分化的方法。方法 使用酶消化法分离原代DPSC,通过流式细胞术表征表面标志物以及三系诱导分化鉴定其多向分化潜力。添加20 ng/mL bFGF和20 ng/mL EGF的单层培养方法诱导DPSC向神经向分化,通过Western Blot、q-PCR检测神经相关标志物随诱导时间增加发生的改变,通过免疫荧光染色检测表面标志物改变。通过止血钳夹闭的方式构建大鼠坐骨神经损伤模型,胰酶消化收集诱导6d的dDPSC,注射到损伤处,4周后通过HE染色和免疫荧光染色检测神经修复情况。结果 获取的DPSC经流式细胞术、三系诱导分化鉴定,符合间充质干细胞特征。Western Blot、q-PCR结果表明Nestin、GFAP随诱导时间增加而上升,在6~9 d趋于稳定。细胞免疫荧光染色结果显示dDPSC的CD73、CD146表达下降,而Nestin、GFAP的表达升高。HE染色显示,PBS组的坐骨神经损伤严重,发生神经变性,而dDPSC组的神经组织结构与对照组类似。NF200/S100β的免疫荧光染色结果显示dDPSC组轴突和髓鞘再生情况优于PBS组。结论 酶消化法分离得到的DPSC纯度良好,通过添加20 ng/mL bFGF和20 ng/mL EGF培养的单层培养法培养6 d可以诱导DPSC向神经前体细胞分化,dDPSC对大鼠坐骨神经损伤的恢复有一定的促进作用。

负载褐藻多酚的丝素蛋白GBR生物膜制备及其性能的体外实验研究

目的通过制备负载褐藻多酚(PT)的双层丝素蛋白(SF)膜,测试其力学性能、生物相容性及其对成骨分化的影响,研究其作为引导骨再生屏障膜的可能性。方法将不同脱胶时间处理后的SF溶液通过溶液浇筑技术、定向冷冻技术以及冷冻干燥技术处理后制备成SF双层膜,采用力学万能试验机测定湿态条件下各组膜样品(n=5)的抗拉强度。取抗拉强度最大的SF双层膜所对应的SF溶液重新制备膜样品,用扫描电镜观察其微观结构。通过在粗糙面负载PT制备PT-SF双层膜,使用傅里叶红外光谱仪分析PT与SF双层膜的相互作用。利用扫描电镜观察人牙槽骨来源的骨髓间充质干细胞(hABMSCs)在粗糙面的黏附情况,通过CCK-8及活死细胞染色探究PT-SF双层膜的生物相容性。用qRT-PCR法、ALP染色和茜素红染色检测各组hABMSCs的成骨向分化情况。结果由脱胶时间为30 min的SF溶液制备出的SF双层膜的抗拉强度最大,达(3.293±0.1228)MPa。SF双层膜的光滑面致密光滑,粗糙面呈纵向有序的疏松多孔结构。褐藻多酚通过氢键、疏水作用力等方式负载到SF双层膜的粗糙面上,空白组、SF组及PT-SF组之间的CCK-8及活死细胞染色结果均无明显差异,且与空白组和SF组相比PT-SF促进了hABMSCs的成骨向分化。结论PT-SF双层膜兼具良好的机械性能和生物学性能,可在一定程度上促进hABMSCs的成骨向分化。该研究成功制备了PT-SF双层膜。

人牙源性间充质干细胞成骨分化潜能的比较

目的比较人根尖乳头干细胞(SCAPs)、牙髓间充质干细胞(DPSCs)和牙槽骨间充质干细胞(ABMMSCs)的体外成骨分化能力。方法取智齿和牙槽骨组织,分别提取根尖乳头干细胞、牙髓和牙槽骨间充质干细胞,待细胞贴壁后传代。在显微镜下观察原代和P3代的细胞形态;流式细胞仪检测细胞免疫表型;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Cell Counting Kit-8试剂盒分析细胞的衰老状态和增殖能力;成骨诱导后进行碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色以及qRT-PCR检测成骨相关基因比较成骨能力。结果3种细胞形态无明显差异,呈现成纤维细胞形态,长梭形,传代后细胞形态光滑一致;3种细胞无衰老差异,均保持稳定增殖能力,SCAPs的增殖能力明显高于其他2种细胞,ABMMSCs的增殖能力较弱;7 d和14 d成骨诱导后ALP染色和茜素红染色表明ABMMSCs的成骨能力明显强于SCAPs和DPSCs;qRT-PCR检测显示ABMMSCs的成骨相关基因升高最为显著。结论SCAPs、DPSCs和ABMMSCs具有稳定的生物学性能,均可进行成骨分化,ABMMSCs体外成骨能力强于DPSCs和SCAPs。

低氧诱导因子-1α的研究进展

在贫血、外伤、组织坏死及缺损等情况下,组织或细胞常处于低氧状态。低氧导致一系列转录诱导因子的表达,它们参与了血管形成,铁、糖代谢及细胞的生长和增殖。其中,低氧诱导因子-1α(HIF-1α)对血管的发生及细胞的生长起决定性作用。近年来研究发现,HIF-1α除了可以诱导血管生成外,对骨形成也有一定的作用。本文就HIF-1α的分子结构、下游靶基因及促进成骨方面的研究进展作一综述。

HIF-1α促进BMSCs成骨及成血管作用的体内外研究

目的:运用基因工程技术,检测HIF-1α基因诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)在体内、外向成血管和成骨方向分化的作用。方法:(1)HIF-1α基因突变后,应用Lentivirus构建Lenti-LacZ、Lenti-WT、Lenti-MT。(2)分别用Lenti-LacZ、Lenti-WT及Lenti-MT转染BMSCs,检测①细胞转染效率;②目的基因在mRNA及蛋白水平的表达;③目的基因在BMSCs细胞内的定位。(3)BMSCs成功转染目的基因后,分别在特定时间点提取总RNA和蛋白,通过RT-PCR和Western印迹检测目的基因对BMSCs成血管和成骨因子表达的调控作用。(4)行碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)和钙结节的表达检测。(5)检测生物支架材料-明胶海绵(GS)的结构、形态及细胞附着情况。(6)建立F344大鼠颅骨双侧直径5 mm的标准骨缺损模型,分别将细胞复合支架材料植入骨缺损区。术后8周取材,行Microfil灌注,观察血管形成,通过大体标本观察、X线及Micro-CT检查、组织学和形态学检测等观察骨修复情况,采用SPSS10.0软件包对结果进行单因素方差分析,评价修复效果。结果:当感染复数(MOI)=15时,BMSCs的转染效率最高。免疫荧光检测表明,目的基因在BMSCs细胞核内。体外常氧条件下,HIF-1α能够显著上调BMSCs的成骨和成血管因子的表达,且ALP和钙结节结果表明目的基因可诱导BMSCs骨向分化。体内实验结果显示,8周时,Lenti-WT组和Lenti-MT组对骨缺损的修复作用明显强于Lenti-LacZ组,而Lenti-MT组又优于Lenti-WT组。结论:HIF-1α基因可以显著提高BMSCs成血管和成骨活性。

帐篷钉技术在牙槽骨修复与再生中的临床应用及操作规范

牙槽骨是牙医学的基础,牙槽骨缺损的修复与再生和口腔种植、口腔正畸、牙周及口腔修复等亚专业学科关系密切。因此,对牙槽骨进行有效的修复与重建具有重要的临床意义和社会效益。随着引导骨再生(guide bone regeneration,GBR)技术的发展,基于以"稳定为核心"的牙槽骨修复与再生理念,一种全新的骨增量技术快速发展,且在临床上获得了有效验证,即基于帐篷钉技术的骨增量方案。该技术具有技术敏感性低、操作简单、手术时间短及费用低等特点。另外,可以单纯应用生物医用材料,在不需要自体骨参与的情况下完成牙槽骨严重缺损的修复与再生。因此,该项技术获得了越来越多医师和患者的青睐。但目前广大医师对如何正确将其有效用于临床仍面临诸多困难,如正规手术操作流程、帐篷钉放置的位置及方向、放置可吸收生物膜与放帐篷钉的顺序以及安放配钉的位点等。鉴于此,本项目组基于临床手术操作流程,撰写了帐篷钉技术在牙槽骨修复与再生中临床应用操作规范,旨在为广大口腔医师在应用该项技术时提供一定的参考和依据,并对其临床推广应用起到积极作用。

转人B7-H3基因鳞癌细胞株的建立及其检测

目的探讨转入B7-H3基因鳞癌细胞株的建立及其检测。方法采用脂质体介导法将已建好的真核表达质粒pEGFP-C1-B7-H3导入人鳞癌细胞Tca8113中(Tca8113/B7-H3),RT-PCR检测B7-H3在该细胞中的表达,Western blot检测其蛋白的表达。经G418筛选后,用有限稀释法建立稳定高表达的带有B7-H3基因的Tca8113鳞癌细胞株。结果RT-PCR方法检测到目的基因B7-H3的一个215bp大小的cDNA扩增产物;DAB显色,裂解的Tca8113/B7-H3基因转染细胞膜蛋白中相对分子质量约65～86ku大小的特异性条带。转染B7-H3的Tca8113细胞,经过细胞传代培养后仍然能够检测到高表达的B7-H3基因,经过有限稀释法建立了Tca8113/B7-H3细胞株。结论成功建立了Tca8113/B7-H3细胞株,为以后的体内外试验提供了很好的平台,为近一步研究其抗肿瘤作用奠定了基础。

颌骨放射性骨坏死治疗进展

放射治疗是头颈部肿瘤常用的辅助治疗方法 ,其往往与化学治疗同时进行,可为晚期或无法手术切除的肿瘤提供治疗可能。但放射线作用于肿瘤细胞时,可杀伤正常组织细胞,发生临床上最严重的并发症即放射性骨坏死(osteoradionecrosis,ORN)。而针对ORN,目前缺乏有效的治疗手段。本文就ORN的研究进展作一概述,希望能为今后ORN的有效治疗提供新的思路。

骨髓基质细胞中Von Hippel-Lindau基因的siRNA表达载体构建及其检测

目的:构建骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells BMSCs)中Von Hippel-Lindau(VHL)基因的siRNA表达载体并检测其对BMSCs细胞中VHL基因的干扰作用。方法:根据犬的VHL基因序列设计并合成4对siRNA oligo,然后用载体构建试剂盒进行重组克隆,将4对双链的siRNA oligo分别插入到siRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中,构建4个siRNA表达质粒(SR144-1,SR144-2,SR144-3,SR144-4)。用载体通用引物进行菌落PCR筛选,筛选得到的阳性克隆进行测序,以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的oligo序列一致。干扰载体瞬时转染BMSCs,通过qPCR和Western印迹分别检测干扰载体对目的基因的沉默效果。为了提高转染效率及VHL基因的沉默效果,对SR144-4进行慢病毒干扰载体(pLenti-mi-VHL)构建。结果:通过对构建质粒克隆进行测序,证实重组克隆中插入片段序列与设计的oligo序列一致,转染BMSCs细胞24h和48h后分别用qPCR与Western印迹检测,显示SR144-4干扰效果最理想。通过测序结果比对,插入序列完全正确,pLenti-mi-VHL构建成功。结论:成功构建了BMSCs的siRNA-VHL表达载体,为进一步实验研究奠定了基础。

人共刺激分子B7-H3表达载体的构建及表达检测

目的:B7-H3作为B7家族的最新成员,其受体在活化的T细胞表面可被诱导表达,B7-H3对CD4+和CD8+细胞的生成均具有增加作用,并可选择性增加IFN-γ的生成。为将B7-H3基因转染入舌鳞癌细胞Tca8113中制备瘤苗,克隆人共刺激分子B7-H3基因,构建其真核表达载体,并检测B7-H3基因在Tca8113中的表达。方法:从淋巴细胞中提取RNA,用RT-PCR方法将B7-H3的编码序列cDNA扩增。然后将该基因的编码序列插入真核荧光蛋白载体pEGFP-C1中,构建成最终的表达载体pEGFP-C1-B7-H3。运用脂质体方法将pEGFP-C1-B7-H3转染Tca8113细胞,转染24h后,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR检测B7-H3在该细胞中的表达。结果:从淋巴细胞中提取的RNA质量较好,经RT-PCR扩增出目的基因B7-H3,其全长大小为951bp。测序鉴定,该序列与GenBank中序列相同。转染pEGFP-C1-B7-H3载体的靶细胞Tca8113中,荧光显微镜下可见其表达绿色荧光蛋白,RT-PCR方法检测到目的基因B7-H3的一个215bp大小的cDNA扩增产物。结论:酶切及RT-PCR证实成功构建人B7-H3的真核表达载体pEGFP-C1-B7-H3,将该载体转染到Tca8113中,RT-PCR鉴定B7-H3基因在该细胞中表达。

浅谈口腔临床医学专业学位研究生与住院医师规范化培训并轨培养模式的科研能力训练

随着我国住院医师规范化培训制度的建立,新一轮口腔医学教育改革提出了口腔临床医学专业学位研究生与住院医师规范化培训并轨培养的模式,即培养应用型口腔医学人才。本文分析了口腔临床专业学位研究生临床能力培养的必要性,以及并轨培养模式中科研能力训练方面可能存在的问题,并提出了相应的建设性解决方案。

牙槽骨骨增量技术新进展

牙槽骨缺损是一类常见的口腔疾病,严重影响患者的口腔功能、颌面美观及身心健康,极大地降低了患者的生活质量。炎症、外伤、肿瘤切除及某些先天性疾病常可导致牙槽骨缺损,这给以牙槽骨重建为基础的手术治疗方案带来极大的挑战。因此有效完成牙槽骨的修复与再生,对重建口腔功能具有重要意义。随着生物医用材料学的快速发展及临床治疗手术方法的不断创新和改进,牙槽骨修复与再生的可预期性日益增强,可供选择的治疗方式越来越多。本文就目前临床应用较为广泛且可预期性较高的骨增量技术作一简要概述。

MicroRNA在血管形成中的调控作用

血管再生和形成对创伤愈合、缺血性疾病治疗及骨缺损修复重建等具有重要作用。小分子RNA(MicroRNAs,miRNAs)是一类小的内源性非编码RNA,通过作用于靶mRNA,促进降解或转录,抑制调控基因的表达。目前证明miRNAs在血管再生和血管性疾病中发挥重要作用。本文综述miRNAs在血管形成、聚集,特别是缺血后新生血管形成中的作用,希望为临床上miRNAs治疗缺血性疾病和骨修复重建提供新的思路。

B7-H3基因调控肿瘤免疫治疗的新进展

免疫治疗是继手术、放疗、化疗之后的又一种肿瘤治疗方法。共刺激分子B7家族在肿瘤基因治疗中的作用已成为肿瘤研究的热点之一。B7-H3基因是B7家族的最新成员,本文就其在肿瘤免疫治疗中的作用作一综述。

低功率激光在骨折治疗中的应用

激光在损伤、溃疡等软组织疾病中的应用比较常见,而在骨折等硬组织疾病中的应用尚不多见。随着动物实验及临床研究的不断深入,低功率激光在骨折治疗中的作用越来越受到人们的重视。本文就低功率激光照射在骨折治疗中的作用及影响作一综述。