医学院校开展流式细胞技术培训的应用与体会

流式细胞术是一项功能强大的生物检测分析技术,在医学科研中应用广泛。文章详细介绍了近年来结合流式技术特点,首都医科大学中心实验室通过理论讲座和实践操作,对用户开展分层次、渐进式、有针对性的细胞检测和分选的技术培训模式,包括分级课程设计、模块化教学和培训效果评估,并探讨性地提出目前培训中存在的问题及可能的解决方案,力争将大型仪器的共享与资源利用最大化。

新疆南部戊肝疫区间隔20年后局部再爆发的调查

为了探讨戊肝流行 2 0年后再爆发的特点 ,对 2 0 0 1年喀什地区莎车县某乡戊型肝炎的流行和临床特点进行了调查 ,并对病后半年的部分病例用ELISA方法检测戊肝抗体水平。结果发生在 1981～ 1983年大流行时散发病的疫区 ,间隔 2 0年后再次局部爆发戊肝 ,乡总患病率 0 .6 4 % (16 7/ 2 5 979) ,分布在相邻六个自然村 ,每村平均患病人数为 2 8人。饮用水为手压井 (地下水 ) ,全年以 8～ 12月为一高峰 ,均为维族农民 ,男 98人 ,女 6 9人 ,最大年龄 5 4岁 ,最小年龄 12岁 ,中位年龄 2 8.9岁。临床表现符合急性黄疸型肝炎 ,病情轻 ,无重症和死亡病例。抽查病例中病后半年抗 HEVIgG阳性率 6 8% ,IgM阳性率 16 % ,双阳性 12 %。首发病例传染源尚不清楚 ,可排除水源和食物污染 ,流行和临床特征符合戊肝 。

抗-HEV的临床意义

为了探索散发性戊型肝炎抗体的临床意义。采用ELISA方法检测。结果为 10 2份抗 HEV阳性血清中抗 HEV·IgM+ 72份 (占 70 .6 % )、IgG+ 2 1份 (占 2 0 .6 % )、双阳性 9份 (占 8.8% ) ;IgM阳性与急性期病程和ALT异常呈现正相关。认为抗 HEV·IgM/IgG临床判断IgM为诊断标志、IgG为感染标志 ;疫区急性期内再感染可能性极少 ;城市散发戊肝食源性感染是主要传播方式之一 ;

成骨细胞的体外培养及其生物学特性

目的 :建立体外分离、培养兔和人成骨细胞的生物学模型 ,并对其生物学特性进行观察。方法 :抽取新西兰兔骨髓 ,采用全骨髓法培养 ;人髂骨松质骨经胰酶消化获得成骨细胞 ,以 1× 10 6 / ml的细胞浓度进行培养 ,约10 d左右得到贴壁生长的单层细胞。随后传代培养 ,对所获得的细胞进行生物学特性观察。 结果 :获得的细胞呈多种形态 ,有长短不一、粗细不均、互相连接的胞浆突起 ,细胞可相互重叠呈复层生长 ,并形成钙结节。经连续传代 ,细胞形态与功能不变 ,具有典型成骨细胞的生物学特性。结论:无论采用兔骨髓基质细胞全骨髓法 ,还是人松质骨经胰酶消化法均能在体外培养出大量高纯度成骨细胞 ,方法简便、易行 ,为成骨细胞复合生物降解材料移植修复骨缺损奠定了基础 ,而且培养的成骨细胞可作为生物学模型 ,供干预研究使用。

鸡红细胞标准品在胶质瘤细胞DNA周期检测中的意义

目的自制鸡红细胞标准品在脑胶质瘤细胞周期检测中的应用。方法选2例病理2级和2例4级脑胶质瘤患者术中切除的新鲜肿瘤组织提取单细胞悬液,加入自制鸡红细胞做内参,70%乙醇过夜,用PI荧光染料标记细胞,用流式细胞仪检测DNA含量。结果鸡红细胞替代正常二倍体细胞与肿瘤细胞同时染色,4例脑胶质瘤DNA检测结果为1例2级患者可见肿瘤细胞和鸡红细胞G0/G1期峰荧光道数值分别为83.411和27.779,DI值1.000 9;另1例2级患者为82.545和27.811,DI值0.989 4。1例胶质瘤WHO 4级患者肿瘤细胞和鸡红细胞G0/G1期峰道数值分别为87.562和26.275,DI值1.111 0。这3例患者的DNA直方图上除鸡红细胞G0/G1期峰外只见1个患者细胞的G0/G1期峰。另1例胶质瘤WHO 4级患者直方图上可见鸡红细胞和三个倍体峰,G0/G1期峰道数值分别为81.682、96.075、120.243和23.806,DI值分别为1.143 7、1.345 2、1.686 1。结论鸡红细胞为内参,可以准确计算并识别脑胶质瘤细胞DNA各个倍体,甚至内参照是计算DI值必不可少的参照物。这4例DNA周期分析结果和病理结果完全吻合,是一种客观的辅助诊断手段,可以推广至各种肿瘤的检测中,并可用于仪器的评估和校准。

鸡红细胞标准品制备及其在流式细胞仪DNA周期检测中的应用

目的:制备鸡红细胞标准品并探索其在流式细胞仪DNA周期检测中的应用。方法:采集鸡红细胞制成纯净红细胞,然后用乙醇固定,放于4℃冰箱备用。用PI荧光染料标记鸡红细胞和分别加入鸡红细胞的人结肠癌细胞SW480、人喉癌细胞系Hep2、人肺腺癌细胞A5494,用流式细胞仪检测DNA含量。结果:鸡红细胞替代正常二倍体细胞与肿瘤细胞同时染色,直方图显示两种细胞G0/G1期峰位置相差大,可清晰分辨,得到肺腺癌细胞A549的G0/G1期峰道数和鸡红细胞峰道数比值为4.712 0,喉癌细胞系Hep2的G0/G1期峰道数和鸡红细胞峰道数比值为7.096 2,结肠癌细胞SW480的G0/G1期峰道数和鸡红细胞峰道数比值为4.523 4。结论:利用流式细胞术,以鸡红细胞为内标标记,可以准确计算并识别多种肿瘤细胞DNA倍体,并且可以辅助流式检测的质量控制,此方法简便易行值得推广。

mRNA差异显示法在维吾尔族和哈萨克族2型糖尿病患者白细胞差异基因筛选中的应用

目的选择、研究三代内未和其他民族通婚的维吾尔族2型糖尿病患者与维吾尔族正常人,哈萨克族2型糖尿病患者与哈萨克族正常人之间外周血白细胞mRNA差异表达,寻找致糖尿病基因和抑糖尿病基因。方法应用荧光mRNA差异显示技术分析、鉴定外周血白细胞的差异表达片段,测序后进行同源性分析。结果Z5、Z8、Z15三个差异表达明显的cDNA片段在正常人中高表达,而在2型糖尿病患者中低表达或不表达。其中Z5、Z8与CREG1基因同源,Z15基因未知。结论三个在两个民族正常人高表达,而患者缺乏或低表达的基因,可能与抑糖尿病基因有关,可能是2型糖尿病的病因之一。

维吾尔族和哈萨克族2型糖尿病患者白细胞mRNA差异显示比较分析

目的:寻找维吾尔族2型糖尿病人与维吾尔族正常人、哈萨克族2型糖尿病人与哈萨克族正常人以及2个民族2型糖尿病人之间外周血白细胞mRNA差异表达的基因。方法:应用荧光mRNA差异显示技术分析2个民族2型糖尿病人和正常人外周血白细胞,分离差异表达的基因片段后测序,测序结果提交GenBank进行同源性分析。差异条带经反向Northern blot验证。结果:发现2个民族糖尿病人与正常人之间均存在差异片段,但差异并不集中在某个民族的正常人或2型糖尿病人中,而是离散分布。筛选出的12个差异表达明显的cDNA片段高度同源于人类染色体上的某些区域,但50%以上功能目前尚不清楚。结论:发现的12个在维吾尔族和哈萨克族2型糖尿病人与正常人外周血白细胞中差异表达的基因可能与2型糖尿病有关。

pLentiLox3.7完整慢病毒颗粒对HEK-293细胞的生物学影响

目的通过实验观察无外源基因的慢病毒颗粒对HEK-293细胞产生的生物学影响,为选择以何种方式获得重组慢病毒感染的目的细胞提供基础依据。方法以pLentiLox3.7慢病毒核心空载体和包装质粒VSVG、RSV-REV和pMDLg/pRRE按一定比例混合,采用脂质体共转染,将慢病毒载体系统的4质粒共转染HEK-293T细胞,收获病毒原液,再以浓缩的病毒原液或等体积的培养基加入培养中的HEK-293细胞,观察细胞的形态变化,分析其染色体并采用流式细胞术分析细胞周期。结果按照本实验中慢病毒包装的质粒比例及包装过程获得的浓缩病毒液使得HEK-293细胞具有融合趋势,染色体分析后表明细胞尚未真正融合,但流式分析显示一定量的慢病毒可使得S期的细胞比例显著增多。结论一定量的慢病毒对细胞具有融合趋势,建议取低浓度含有荧光筛选标签的重组慢病毒感染目的细胞,培养之后再进行流式无菌分选以获得较纯的目的细胞。

子午沙鼠感染戊肝病毒传代的实验研究

目的 :子午沙鼠实验感染HEV的传代研究。方法 :选健康子午沙鼠腹腔接种含HEV的人粪便悬液 ,接种后观察 43～ 5 0d ,分别记录临床表现、酶血症和排毒结果、肝组织学改变。第 1代 7只 ,第 2、3代各 2 0只 ,依次进行逐代感染 ,连续 3代。结果 :临床表现不明显 ,酶血症反应 3代基本一致 ,第 6d开始 ,5 0d渐复常 ,呈双峰型 ;肝组织学改变 :经光镜和电镜检查显示 ,与人戊肝病理改变相似。结论 :实验证实子午沙鼠可连传 3代 ,有与人类戊肝相似的特征 。

成人骨髓基质细胞体外培养及鉴定

目的 :探讨简易的成人成骨细胞体外培养方法 ,为进一步研究成骨细胞及骨组织工程提供技术平台。方法:手术中抽取健康成人骨髓组织 ,采用全骨髓培养法在体外进行培养 ,细胞汇合后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素 C的条件培养基进行传代培养 ,观察细胞增殖和分化情况 ,并对细胞进行鉴定。结果:培养的成人成骨细胞表现出成骨细胞的形态特征 ,细胞碱性磷酸酶 (AL P)阳性率为 6 8% ,经 Von Kossa's染色证实其能最终形成钙结节。结论:全骨髓培养法所培养的细胞具有成骨细胞的特性 ,可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法。

合成HBcAg多肽干预灰旱獭感染HBV的实验研究

目的 研究合成HBcAg多肽干预灰旱獭感染HBV的作用。方法 合成筛选的HBcAg多肽Ⅰ、Ⅱ二个片段 ;选对HBV DNA产生血清反应的 10个灰旱獭 ,均分 5组实验 :第一组HBV M全阴性单注HBcAg多肽Ⅰ、Ⅱ。第二组HBV M全阴同注多肽Ⅰ、Ⅱ和含HBV DNA的人血清。第三、四组为HBcAb+ 组注多肽Ⅰ、Ⅱ。第五组为HBV M全阴注生理盐水对照组。结果 第一组注多肽后 2 8dHBcAb+ 伴有酶血症 ,190d时出现抗 -HBs+ 持续存在 2 10d。第二组注射后观察 30 5dHBV M仍为全阴性。第三、四组注后随访 15 0d和 36 0dHBV M均为阴性。第五组 (对照组 )无任何反应。结论 选择的多肽片段有阻断HBV感染和使HBcAb转阴的作用 ,即抗

407nm激光流式细胞仪检测小鼠骨髓侧群细胞效果研究

流式细胞仪分选Hoechst 33342拒染侧群细胞是获得高纯度干细胞的重要方法,但由于检测技术单一,实验受客观条件限制大,无法广泛开展,本研究探讨了一种利用紫色激光和适当接收通道代替紫外激光检测侧群细胞的新方法,通过比较利血平阻断染料排出前后的检测结果验证这一方法的可靠性,结果提示此方法可以有效识别侧群细胞,可以作为紫外检测的替代方法。

灰旱獭感染HBV的临床和病理分析

目的 探讨灰旱獭感染HBV后临床表现、病理改变及其相关关系。方法 ①用含HBV DNA人血清对健康灰旱獭攻毒 ,依次传代 ,分析其临床血清学变化与病理改变的相关性。②用合成HBcAg多肽分别接种 :对HBcAb- 旱獭单用多肽Ⅰ、Ⅱ或多肽Ⅰ、Ⅱ与HBV DNA同时注射 :对HBcAb+ 旱獭注射多肽Ⅰ、Ⅱ。结果 ①攻毒与传代后临床反应的轻重与肝脏病理变化的程度一致。②HBcAg多肽具有核心蛋白疫苗的作用。可激发抗体的形成 ,阻断HBV的攻毒 ,使HBcAb转阴 ,与肝组织炎症反应一致。结论 肝组织炎变与血清变化密切相关 ,证实攻毒、传代结果可靠。多肽具有阻断、干预灰旱獭感染HBV的作用。

抗HEV ELISA定性和定量分析的相关性研究

作者采用抗HEV ELISA方法和线性相关回归分析,初步探讨了不同病期抗HEVIgM/IgG定性和定量分析的相关性及临床应用价值。结果显示拟建立的线性函数方程均成立(P<0.01),并呈现良好的正相关关系(P<0.01),同一指标不同病期两直线相关系数间无统计学显著性差异(P>0.05).预报精度和残差分析表明,急性期抗HEV IgM和恢复期抗HEV IgG变异程度相对较低,预报精度较高,故两者更具有较大临床和流行病学实用价值。

用7-AAD检测细胞DNA含量的流式细胞技术

目的:探索利用荧光染料7-AAD检测细胞DNA含量的流式细胞技术。方法:利用7-AAD和PI两种荧光染料标记小鼠胸腺T淋巴细胞,通过流式细胞仪检测其G0/G1期、S期和G2/M期的DNA含量,比较2种方法测定结果。结果:通过流式细胞仪对细胞周期进行分析显示:用7-AAD和PI两种荧光染料标记的小鼠胸腺T淋巴细胞呈现完整的细胞周期,G0/G1期细胞含量为73.2%±1.93%、73.9%±1.79%,S期细胞含量为23.6%±1.04%、22.6%±1.50%,G2/M期细胞含量为3.2%±0.28%、3.5%±0.21%,两种标记方法测定结果基本一致。结论:本文探讨的7-AAD染色检测DNA含量法与常用的PI标记法相比较结论一致,且操作上更为简单快捷,是一种值得推广的DNA周期分析染色方法。

HBV/HCV重叠感染的血清学研究

乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)均可通过胃肠外途径传播,具有相似的临床和流行病学特点,并存在着不同程度的共感染或重叠感染。本文采用ELISA和PCR方法初步探讨不同血清学感染模式中HBV和HCV的相互关系。现将结果报告如下。 资料和方法 一、一般资料 选择1995年8月至1997年8月本院传染科和消化内科住院及门诊患者,诊断按1995年北京全国传染病寄生虫病学术会议修订的病毒性肝炎标准。共计348例,其中汉族197例,少数民族151例,男女之比2.8:1,平均年龄37.2±4.8岁(19～70岁)。

儿童青少年急性散发性HAV和HEV感染的临床流行病学研究

初步探讨０－１８岁儿童青少年ＨＡＶ和ＨＥＶ感染的流行特点，临床表现和血清学规律。要用ＥＬＩＳＡ对１１３例患者同步进行抗ＨＡＶ和抗ＨＥＶ血清学标志的检测，并采用临床流行病学方法进行比较分析。结果ＨＶＡ和／或ＨＥＶ感染临床表现酷似，故应联合检测抗ＨＡＶＩｇＭ和抗ＨＥＶＩｇＭ／ＩｇＧ， 帮助ＨＡＶ或ＨＥＶ感染的早期诊鉴别诊断。

雷公藤甲素对脑胶质瘤细胞凋亡的影响及机制探讨

目的研究雷公藤甲素(TP)对脑胶质瘤细胞u87的细胞凋亡、线粒体膜电位和ROS生成的影响,探讨其诱导细胞凋亡的机制。方法体外培养U87细胞,用10,50,250,1 250 nmol/L四个浓度雷公藤甲素作用于细胞24小时后,流式细胞仪检测细胞凋亡,细胞线粒体膜电位,以及活性氧。结果随着药物浓度的增加,细胞凋亡率逐渐增加,线粒体膜电位检测到绿色荧光区域细胞比例逐渐增多,细胞活性氧生成水平逐渐升高,与对照组比差异有统计学意义,TP对细胞凋亡的诱导作用与药物浓度呈正相关。结论雷公藤甲素可体外诱导U87细胞凋亡,机制可能与线粒体信号通路参与了TP诱导的细胞凋亡,同时通过细胞氧化应激反应,升高ROS,诱导细胞凋亡有关。