一种基于胚胎干细胞构建角膜上皮样组织的新方法

目的利用Rock抑制剂联合低氧-常氧培养方式构建基于胚胎干细胞(ESCs)的组织工程角膜上皮。方法应用贴壁培养作为分化方式,用全反式维甲酸(RA)+骨形态发生蛋白4(BMP4)诱导人源ESCs细胞系H1向角膜上皮样细胞分化。以SHEM与KSFM培养基1∶2混合配比作为扩增基础培养基,分别添加或不添加Rock抑制剂Y27632,扩增ESCs来源的角膜上皮样细胞。将诱导后的角膜上皮样细胞接种于去上皮羊膜载体上,在低氧、常氧、低氧-常氧相结合等不同条件下构建组织工程角膜上皮。通过形态学、实时荧光定量PCR反应(RTFQ-PCR)、免疫荧光法检测诱导效果、ESCs来源角膜上皮样细胞的扩增能力及组织工程角膜上皮表型。结果与对照组比较,诱导组诱导后8 d ESCs标志物Oct4 mRNA,Notch信号通路相关因子Notch1、Jagged1 mRNA以及Wnt信号通路的相关因子c-myc和Cyclin D1 mRNA的相对表达量显著降低,表皮外胚层标志物p63和K18 mRNA的相对表达量显著增加,差异均有统计学意义(t=14.63、20.15、93.50、11.60、19.30、18.44、22.63,均P<0.05)。与Y27632未添加组相比,Y27632添加组细胞的p63、K14 mRNA相对表达量以及Notch信号通路受体Notch1和Jagged1 mRNA相对表达量显著升高,Wnt信号通路下游靶向基因c-myc和CylinD1 mRNA相对表达量明显降低,差异均有统计学意义(t=20.29、59.22、2.90、39.59、5.32、10.14,均P<0.05);2个组K18 mRNA的相对表达量无明显变化,差异无统计学意义(t=1.38,P>0.05)。Y27632添加组用低氧-常氧相结合的方式构建ESCs来源的上皮片较持续低氧或常氧培养复层化更明显,排列更紧密,并全层表达上皮细胞标志物Pan-CK和K18及上皮干细胞标志物p63和K14。结论Y27632的添加可增加ESCs来源角膜上皮样细胞的增生能力,激活Notch信号通路,抑制Wnt信号通路。采用低氧-常氧相结合的方式,利用添加Y27632的培养基扩增构建ESCs来源的组织工程角膜上皮有助于上皮片的复层化。

组织工程角膜上皮移植重建眼表面的临床研究

目的观察组织工程角膜上皮移植重建眼表面治疗完全性角膜上皮干细胞缺乏的短期临床效果。方法系列病例研究。6例（6眼）单眼全角膜缘干细胞缺乏患者，包括碱烧伤3例、爆炸伤2例、热烧伤1例。采用去上皮羊膜组织作为载体，体外扩增患者自体健眼角膜上皮干细胞，构建组织工程角膜上皮。然后进行组织工程角膜上皮移植重建眼表面。术前及术后检查指标包括裸眼视力、裂隙灯显微镜、超声生物显微镜、泪液分泌试验。结果患者自体来源的角膜上皮干细胞在去上皮羊膜上培养3周后均可形成直径15mm的复层上皮片。组织工程角膜上皮均成功移植于所有受体眼表面。移植术后3个月．所有患者角膜上皮完整光滑．角膜瘢痕及纤维血管翳明显减轻．6例患者视力均有不同程度的提高。结论患者自体来源的角膜上皮干细胞构建的组织工程角膜上皮移植可以成功重建全角膜缘干细胞缺乏患者的眼表面，为这类患者的复明带来希望。